过氧化物酶、过氧化氢酶活性测定方法及试剂配制

过氧化物酶、过氧化氢酶活性测定方法及试剂配制过氧化物酶(POD)活性测定
【实验原理】
过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中，在有H0存在条件下，过氧化物酶能使愈创木22
酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚，可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。

【实验试剂】愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L 磷酸缓冲液(pH6.0)、反应混合液[100mmol/L磷酸缓冲液(Ph6.0)50mL，加入愈创木酚28uL,加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液溶解冷却后，加入30%过氧化氢19uL，混合均匀保存在冰箱中]
方法步骤】【
(1)、粗酶液的提取称取小麦叶片0.25g，加20mmol/LKH2PO4 2.5mL，于研钵中研成匀浆，以4000r/min离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/LKH2PO4 2.5mL提取一次，全并两次上清液，所得的即为粗酶提取液(酶活性过高，稀释10倍)。

(2)、酶活性的测定取试管3只，于一只中加入反应混合液3mL，KH2PO41mL，作为校零对照，另外三只中加入反应混合液3mL，稀释后的酶液1mL(如表1)，立即开启秒表，于分光光度计470nm波长下测量OD值，每隔1min读数一次(4min)。

以每分钟表示酶活性大小，将每分钟OD值增加0.01定义为一个活力单位。

表1 紫外吸收法测定POD酶活性配置表
管号 S0(对照) S1(实验) S2(实验)
反应混合液(ml) 3.0 3.0 3.0
KH2PO4 (ml) 1.0 0.0 0.0
酶液 (ml) 0.0 1.0 1.0
4.结果计算
以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA 470 /[min ? g (鲜重) ]表示之。

也可以用每 min 内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位( u )表示。

, ， A V 470 T
，，， 0 .0 1 V t FW 1
POD总活性[u/g(FW)]=
式中:POD总活性以酶单位每克鲜重表示。

其中 ?470=ACK-AE
比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。

ACK ——照光对照管的吸光度。

AE ——样品管的吸光度。

Vt ——样品液总体积，mL。

V1 ——测定时样品用量，mL。

W——样品鲜重，g。

蛋白质含量单位为mg/g。

过氧化氢酶的活性测定——紫外吸收法
【原理】
HO在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A)随反应22240时间而降低。

根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。

【试剂】
0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液:取A液91.5ml，B液8.5ml,充分混合。

0.1mol/L HO 以30%的过氧化氢稀释(30*1.1g/34.01)mol/100ml=9.7mol/L,取0.52ml 30%的过22
氧化氢稀释到50ml.
【方法】
1.酶液提取:称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2ml 4?下预冷的pH7.8磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，再用缓冲液冲洗研钵数次定容至25ml，合并冲洗液，混合均匀后置于5?冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液，5?下保存备用。

2.测定:取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表2顺序加入试剂。

表2 紫外吸收法测定HO样品液配置表 22
管号 S0(对照) S1(实验) S2(实验)
粗酶液(ml) 0.2(煮死) 0.2 0.2
pH7.8磷酸(ml) 1.5 1.5 1.5
蒸馏水(ml) 1.0 1.0 1.0
煮死酶在沸水浴中煮沸5min. 30?预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的HO，每加完一管立即22记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔
1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。

3.结果计算:
以1min内A减少0.1的酶量为1个酶活单位(u)。

240
,TA，V240
0.1，V1，t，FW 过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=
式中:POD总活性以酶单位每克鲜重表示。

其中 ?470=ACK-AE
比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。

ACK ——照光对照管的吸光度。

AE ——样品管的吸光度。

Vt ——样品液总体积，mL。

V1 ——测定时样品用量，mL。

W——样品鲜重，g。

蛋白质含量单位为mg/g。

所需试剂的配制
A液:0.2 mol/L Na2HPO4-12 H2O 71.64g定容至1000ml
B液:0.2 mol/L NaH2PO4-2H2O 31.2g定容至1000ml
1、超氧化物歧化酶SOD活性测定
0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.8)取A液228.75ml，B液21.25ml定容至
1000mL。

130mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液:称取1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100mL 750u mol/L氮蓝四唑溶液:称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100mL，用前配避光 100u mol/L EDTA-Na2溶液:称取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000mL。

用前配置，避光保存。

20u mol/L核黄素溶液:称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，用前配置，避光 2、过氧化物酶POD活性测定
愈创木酚、30%过氧化氢、
100m mol/L磷酸缓冲液(pH6.0):分别取贮备液A:0.2 mol/L NaHPO6.15mL溶液与贮备24 液B :0.2 mol/L NaHPO溶液43.85mL充分混匀定容至100mL。

24 20m mol/L KH2PO4:称取0.681g KH2PO4定容至250mL.
3、过氧化氢酶CAT活性测定
0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液,取A液91.5ml，B液8.5ml,充分混合。

0.1mol/L H2O2以30%的过氧化氢配制: 30%的过氧化氢密度为1.1g/立方厘米,分子量为34.01,据理推算:
(30*1.1g/34.01)mol/100ml=9.7mol/L
30% PEG6000 配置方法如下:称取300gPEG ，溶于一定量的水中，最后定容之1000ml ，即为所需的30%PEG的溶液。