5.核酸杂交PPT课件
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2. cDNA探针：是互补与mRNA的DNA分子，理想的 探针，但一般不易获得。
3. RNA探针：注意PolyA，本身易降解。多用于 基因转录研究。
4. 寡核苷酸探针：人工合成 5. 注意：长度；（G+C）%；发卡结构；碱基重
复；特异性
2021/3/10
10
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11
探针的标记
标记物的要求： 高灵敏度 不影响杂交 检测方法灵敏，特异，无污染，价格廉 易操作，稳定性好
2021/3/10
22
2021/3/10
23
Southren blotting意义
主要用于基因组中 特定基因的定性和定量检测 克隆基因的酶切图谱、基因突变分析 基因重排，丢失等分析
2021/3/10
24
Northren blotting
RNA（mRNA）提取 限制性内切酶消化 变性凝胶电泳分离RNA片段 转膜 预杂交 杂交 放射自显影
2021/3/10
12
探针的放射性同位素标记
1.缺口平移法（nick translation）
2.随机引物法（random priming）
3.DNA的5‘末端标记法
5’----GTGCTGATGACCGTA -----3’
碱性磷酸酶切除
5’----TGCTGATGACCGTA -----3’
17
2021/3/10
18
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19
常用分子杂交技术
液相分子杂交
固相分子杂交
支持物（载体）
硝酸纤维素膜
尼龙膜
化学激活膜
乳胶颗粒
磁珠
微空板
2021/3/10
20
Southern blotting原理
2021/3/10
21
Southren blotting 步骤
DNA提取 限制性内切酶消化 琼脂糖电泳分离DNA片段 变性 转膜 预杂交 杂交 放射自显影
核酸杂交
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1
核酸杂交基本原理
1 核酸变性（Denaturation）
双链DNA间氢键断裂，变为两条单链的过 程。
增色效应：变性时溶液对紫外光吸收值 逐渐变大。（260nm）
Tm值：变性温度或解链温度指增色效应 达到一半时，即一半DNA双链解链时的温 度。
Tm值与G+C含量呈正比
互补单链重新缔合成双链的过程。
减色效应
复性速度影响因素：
DNA大小；离子强度；DNA浓度；
2021/3/10
5
分子杂交概念
两条单链之间存在完全或部分碱基序列 互补，相互结合形成双链（molecular hybridization）
2021/3/10
6
核酸杂交类型
DNA-DNA；DNA-RNA；RNA-RNA； OLIGO-DNA；OLIGO-RNA
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7
核酸探针
探针概念（PROBE）：广义 核酸探针：指能与特定核苷酸序列发生
特异性互补杂交，杂交后又能被特殊方 法检测的已知被标记的核苷酸序列。 标记物（示踪物）分类 1. 同位素标记 2. 非同位素标记
2021/3/10
8
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9
探针的种类
1. 基因组探针（某一基因的全部或部分序列）； 应主义内含子和非编码区。
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25
2021/3/10
26
Northren blotting应用
RNA的研究 mRNA表达高低 癌基因，抑癌基因活化
2021/3/10
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斑点杂交（dot blotting）
概念 是一种快速、简便检测微量DNA或RNA
的方法，是将样品点到一张硝酸纤维素 膜上，并将膜划分区域，点多个样品， 烘烤固定，然后杂交现色。 优点： 快速，高通量，半定量 缺点：灵敏度不理想
Bio-7-dATP Bio-11-dCTP Bio-11-dUTP 等
DNA半抗原标记：地高辛Dig-16-dUTP
pg级
酶标：AP；HRP
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16
非放射标记探针的检测
AP 显色体系： P140 HRP显色体系： P140 ABC显色体系： P141
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29
原位杂交
核酸保持在细胞或组织切片中，经适当 方法处理细胞或组织，将标记的核酸探 针与细胞或组织切片中核酸，进行杂交 称为原位杂交。
特点：不需要提取核酸
可定性定量
可定位。
2021/3/10
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2021/3/10
31
共同的心声
一起帮助孩子更好学习， 一起帮助孩子健康成长。
起核酸变性的因素
酸、碱、热、变性剂（尿素、胍） 有机溶剂（乙醇、丙酮） Tm（85-95度之间） Tm=69.3+0.41（G+C） Tm的影响因素： GC含量；离子强度； PH值；变性剂
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4
核酸的几个基本概念
2. 核酸的复性（Renaturation）
T4酶 + （32P）ATP
5’---- （32P）ATGCTGATGACCGTA -----3’
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13
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14
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15
探针的非放射标记
光敏生物素标记：光生物素；补骨脂素 生物素；当归素生物素等。（pg级）
酶促生物素标记：Bio-16-dUTP ，
3. RNA探针：注意PolyA，本身易降解。多用于 基因转录研究。
4. 寡核苷酸探针：人工合成 5. 注意：长度；（G+C）%；发卡结构；碱基重
复；特异性
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探针的标记
标记物的要求： 高灵敏度 不影响杂交 检测方法灵敏，特异，无污染，价格廉 易操作，稳定性好
2021/3/10
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Southren blotting意义
主要用于基因组中 特定基因的定性和定量检测 克隆基因的酶切图谱、基因突变分析 基因重排，丢失等分析
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Northren blotting
RNA（mRNA）提取 限制性内切酶消化 变性凝胶电泳分离RNA片段 转膜 预杂交 杂交 放射自显影
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探针的放射性同位素标记
1.缺口平移法（nick translation）
2.随机引物法（random priming）
3.DNA的5‘末端标记法
5’----GTGCTGATGACCGTA -----3’
碱性磷酸酶切除
5’----TGCTGATGACCGTA -----3’
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常用分子杂交技术
液相分子杂交
固相分子杂交
支持物（载体）
硝酸纤维素膜
尼龙膜
化学激活膜
乳胶颗粒
磁珠
微空板
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Southern blotting原理
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Southren blotting 步骤
DNA提取 限制性内切酶消化 琼脂糖电泳分离DNA片段 变性 转膜 预杂交 杂交 放射自显影
核酸杂交
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核酸杂交基本原理
1 核酸变性（Denaturation）
双链DNA间氢键断裂，变为两条单链的过 程。
增色效应：变性时溶液对紫外光吸收值 逐渐变大。（260nm）
Tm值：变性温度或解链温度指增色效应 达到一半时，即一半DNA双链解链时的温 度。
Tm值与G+C含量呈正比
互补单链重新缔合成双链的过程。
减色效应
复性速度影响因素：
DNA大小；离子强度；DNA浓度；
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分子杂交概念
两条单链之间存在完全或部分碱基序列 互补，相互结合形成双链（molecular hybridization）
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核酸杂交类型
DNA-DNA；DNA-RNA；RNA-RNA； OLIGO-DNA；OLIGO-RNA
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核酸探针
探针概念（PROBE）：广义 核酸探针：指能与特定核苷酸序列发生
特异性互补杂交，杂交后又能被特殊方 法检测的已知被标记的核苷酸序列。 标记物（示踪物）分类 1. 同位素标记 2. 非同位素标记
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探针的种类
1. 基因组探针（某一基因的全部或部分序列）； 应主义内含子和非编码区。
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Northren blotting应用
RNA的研究 mRNA表达高低 癌基因，抑癌基因活化
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斑点杂交（dot blotting）
概念 是一种快速、简便检测微量DNA或RNA
的方法，是将样品点到一张硝酸纤维素 膜上，并将膜划分区域，点多个样品， 烘烤固定，然后杂交现色。 优点： 快速，高通量，半定量 缺点：灵敏度不理想
Bio-7-dATP Bio-11-dCTP Bio-11-dUTP 等
DNA半抗原标记：地高辛Dig-16-dUTP
pg级
酶标：AP；HRP
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16
非放射标记探针的检测
AP 显色体系： P140 HRP显色体系： P140 ABC显色体系： P141
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2021/3/10
29
原位杂交
核酸保持在细胞或组织切片中，经适当 方法处理细胞或组织，将标记的核酸探 针与细胞或组织切片中核酸，进行杂交 称为原位杂交。
特点：不需要提取核酸
可定性定量
可定位。
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31
共同的心声
一起帮助孩子更好学习， 一起帮助孩子健康成长。
起核酸变性的因素
酸、碱、热、变性剂（尿素、胍） 有机溶剂（乙醇、丙酮） Tm（85-95度之间） Tm=69.3+0.41（G+C） Tm的影响因素： GC含量；离子强度； PH值；变性剂
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核酸的几个基本概念
2. 核酸的复性（Renaturation）
T4酶 + （32P）ATP
5’---- （32P）ATGCTGATGACCGTA -----3’
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探针的非放射标记
光敏生物素标记：光生物素；补骨脂素 生物素；当归素生物素等。（pg级）
酶促生物素标记：Bio-16-dUTP ，