PCR-高效液相色谱法检测线粒体DNA A1555G突变

PCR-高效液相色谱法检测线粒体DNA A1555G突变
蔡筠;罗彩群;谢建生;吴维青;耿茜;徐志勇;郝颖;徐晓昕
【摘要】目的探讨PCR-变性高效液相色谱(PCR-DHPLC)分析技术在检测线粒体(mt)12S rRNA 基因第1 555位A-G均质点突变中的应用.方法 4例临床诊断为氨基糖苷类抗生素耳聋的患者及40例听力正常体检者,分别运用PCR-DHPLC技术、酶切技术及DNA测序技术进行mtDNA1555位点检测.结果 PCR-DHPLC与酶切技术均检测出4例患者mtDNA A1555G突变,在PCR-DHPLC中均呈特征性突变双峰;40 例正常体检者未检测出突变,样品均呈单峰.DNA测序技术证实了DHPLC
及酶切技术的准确性.结论 DHPLC能有效地应用于线粒体DNA A1555G突变的检测,该方法简便,成本低廉,可作为mtDNAA1555G突变位点大样本筛查的的手段.【期刊名称】《临床检验杂志》
【年(卷),期】2011(029)002
【总页数】2页(P87-88)
【关键词】变性高效液相色谱;线粒体;耳聋基因;突变
【作者】蔡筠;罗彩群;谢建生;吴维青;耿茜;徐志勇;郝颖;徐晓昕
【作者单位】深圳市妇幼保健院中心实验室,广东深圳,518048;深圳市妇幼保健院
中心实验室,广东深圳,518048;广州医学院,广州,510182;深圳市妇幼保健院中心实
验室,广东深圳,518048;深圳市妇幼保健院中心实验室,广东深圳,518048;深圳市妇
幼保健院中心实验室,广东深圳,518048;深圳市妇幼保健院中心实验室,广东深
圳,518048;深圳市妇幼保健院中心实验室,广东深圳,518048;深圳市妇幼保健院中
心实验室,广东深圳,518048
【正文语种】中文
【中图分类】R764.4
线粒体(mt)12S rRNA基因第1 555位A-G均质性点突变是使用氨基糖苷类抗生素导致耳聋的分子基础[1-2]，在耳聋人群中阳性率为1%～3%[3]。

利用分子生物学手段检测出mtDNA A1555G突变敏感个体，根据线粒体疾病的母系遗传规律明确家族内未发病的家庭成员，严格禁止其应用氨基糖苷类抗生素, 是目前预防药物性耳聋的最有效方法。

本文介绍用高效液相色谱法(DHPLC)对PCR产物进行变性分离，建立一种经济简便的mtDNA A1555G检测方法。

1 对象和方法
1.1 研究对象本院耳鼻喉科门诊患者4例，其中男性1例，女性3例，年龄7～40岁，均无亲缘关系。

临床诊断为氨基糖苷类抗生素耳聋。

另取同龄段40例临床听力测试在正常范围、家族中不患听力障碍的体检健康亲属作对照，其中男女各20例。

用常规酚-氯仿法提取受检者外周血DNA。

1.2 PCR扩增用primer 5.0软件，在线粒体全部22个tRNA基因处设计一对引物，上游：5′-GCAGTAAACTGAGAGTAGAGT-3′，下游：5′-GGCTCTCCTTGCAAAGTTAT-3′，由上海生工公司合成，扩增序列长度为
463 bp(1 428～1 890位点)。

反应体积为30 μl，含100 ng模板DNA，
5 μmol/L上、下游引物各1 μl，
10 mmol/L dNTP 0.6 μl, 25 mmol/L Mg2+ 3 μl，5 U/μl Taq DNA聚合酶0.3 μl，试剂购自美国MBI公司。

在Bio-Rad公司PCR仪上进行PCR反应，反应参数：95 ℃预变性3 min；94 ℃ 45 s, 60 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s，35个循环；再72 ℃延伸5 min。

1.3 DHPLC分析分别把PCR产物与同一体系已知mtDNA A1555G突变阴性标本PCR产物按1∶1混合后在PCR仪中95 ℃变性5 min，以0.1 ℃/min的速度冷却至55 ℃，再于55 ℃温育15 min，以充分形成异源DNA双链。

将混合产物用DHPLC分析仪(WAVE System 3500，美国环球基因公司)进行分析，自动加样8 μl，通过DHPLC运行软件WAVEMAKER自动计算出最佳分离温度和洗脱液(成分为乙腈和三乙基铵醋酸盐)浓度后，以0.9 ml/min的流速将样本在DNA分离柱中洗脱。

1.4 酶切分析取5 μl PCR扩增产物与10 U/μl AIW内切酶0.5 μl (上海生工公司)，37 ℃温育2 h，65 ℃ 20 min。

经25 g/L琼脂糖凝胶电泳检查。

仅见
463 bp条带，则存在mtDNA A1555G突变；见128 bp和335 bp两条条带，则说明不存在突变。

1.5 测序对44例样本的纯化PCR产物采用双脱氧终止法进行测序，在Beckman公司CEQ 8000遗传分析仪上进行。

2 结果
2.1 DHPLC分析结果经DHPLC筛查，4例患者均出现杂合双峰，健康者出现样品单峰，见图1。

图1 DHPLC分析图谱注：A、B，正常样本DHPLC峰型；C、D，突变样本DHPLC峰型。

2.2 酶切分析结果见图2。

图2 AIW酶切分析电泳图注：泳道 5、7为mtDNA A1555G突变阳性标本，其余泳道为健康对照者样本。

2.3 DNA序列分析结果4例患者均检出mtDNA A1555G突变位点，而40例对照者均未检测出相同突变位点。

3 讨论
目前国内用于检测线粒体12S rRNA基因第1 555位A-G均质点的突变的方法为：PCR扩增线粒体DNA片段，限制性内切酶分析(RFLP)和DNA序列分析[4]。

本实验用DHPLC技术检测4例患者，均出现特征性突变杂合双峰，而40例健康对照者样品只出现单峰，RFLP与DHPLC检测结果相同，DNA测序验证了结果的准确性。

RFLP技术易发生酶切不完全、限制性酶易失效及PCR操作出现污染的情况，DHPLC排除人为因素的干扰，有利于基因检测的质量控制。

而DNA测序试剂昂贵，操作复杂，耗时又耗力，在常规临床检测应用中受到一定的限制。

利用DHPLC对mtDNA A1555G突变的检测，之前在国内尚未有报道。

DHPLC
技术主要针对杂合双链的检测，所以杂合双链的形成是本实验的技术关键。

在实验过程中，野生型和突变型两种PCR产物以1∶1进行混合。

混合产物变性之后，需缓慢降温，温育时间足够长，才能使异源杂合双链充分形成，达到检测效果。

DHPLC高通量，准确率高，成本低廉，操作简单的特性，可作为线粒体
DNA A1555G突变检测的一种简单经济快捷的手段。

4 参考文献
[1]Prezant TR，Agapian JV，Bohlman MC，
et al．Mitochondrial ribosomal RNA mutation associated with both antibio tic-induced and non-syndromic deafness[J]．Nat Genet，1993，4(3)：289-294．
[2]李为民，韩东一，袁慧军，等．非综合征型遗传性聋家系系谱分析及
mtDNA 12S rRNA tRNALeu(UUR) tRNASer(UCN)基因突变分析[J]．临床耳鼻
咽喉科杂志，2004，18(10)：582-589．
[3]Mkaouar-
Rebai E, Tlili A, Masmoudi S, et al. Mutational analysis of the mitochondrial 12S rRNA and tRNASer(UCN) genes in Tunisian patients with nonsyndromi
c hearing loss[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2006, 340(4): 1251-1258.
[4]程祖建，杨滨，江凌，等.等位基因特异PCR结合熔解曲线分析快速检测线粒体DNA A1555G突变[J].临床检验杂志，2009,27(1)：17-19.。