关于最低检测限与线性范围试验的讨论
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2一血清总蛋白测定凯氏定氮法凯氏定氮法参考方法参考方法双缩脲法双缩脲法常规方法常规方法酚试剂法酚试剂法染料结合法染料结合法浊度法紫外光谱法浊度法紫外光谱法一实验原理一实验原理血清中蛋白质分子中的肽键在碱性溶液血清中蛋白质分子中的肽键在碱性溶液中能与中能与cu2作用生成稳定的紫红色络合作用生成稳定的紫红色络合物此反应和两个尿素分子缩合后生成物此反应和两个尿素分子缩合后生成的双缩脲在碱性溶液中与铜离子作用形的双缩脲在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色的反应相似故称成紫红色的反应相似故称双缩脲反应双缩脲反应
回归作统计分析方法。以总蛋白浓度预 期值为横坐标，测定值为纵坐标，在坐
标纸上作图，若所有实验点在坐标纸上
呈明显直线趋势，
建立回归方程y=a+bx，要求a接近于0，
b在0.97~1.03之间，若满足此条件，则可
直接判断该测定方法是否在所要求的线 性范围。
若a较大，b>1.03或<0.97则认为在高浓
临床可报告范围（CRR）：指定量
检测项目向临床能报告的检测范围，患
者样本可经稀释、浓缩或其它预处理。
（一）原理 线性范围是指系统最终输出值（浓度
或活性）与被分析物浓度或活性成比例
的范围。线性范围的测定即测定浓度曲
线接近直线的程度，它反映整个系统的
输出特征。
本试验使用不同浓度的总蛋白标准溶
液，用双缩脲试剂测定各自的浓度，以 标准液预期浓度为横坐标，测得浓度为 纵坐标，在坐标纸上作图，即可绘制出 一条直线，即计量反应曲线。
量。
功能灵敏度（FS）：以日间重复CV
为20%时对应检测限样品具有的平均浓 度确定为检测系统或方法可定量报告的 分析物的最低浓度或其它量值 。
（一）原理
选择合适的空白标本，该标本与待测 标本的区别在于不含有待测物质，一般
用处理过的标本或一般标本，在分析步
骤中省去关键试剂或操作。
本次实验采用蒸馏水作为空白标本，采 用双缩脲法进行多次测定，求出吸光度 的均值及标准差，计算最低检测限。
2+ OH
紫红色络合物
在540nm波长处有吸收峰，在一 定浓度范围内其吸光度增加与蛋白含 量成正比，由此可求得蛋白质含量。
（二）实验试剂
1、双缩脲试剂
氢氧化钠、酒石酸钾钠
硫酸铜、碘化钾 2、标准液 总蛋白 50g/L
（三）操作方法 1、操作参数： 波长：540nm 温度：37℃
测定模式：终点法
2.操作步骤
（二）操作步骤
（ul） B S 20 U（1----10）
DH2O
标准液
20
双缩脲试剂 1000 1000 1000 混匀，37℃水浴10分钟，在540nm波长处， 用空白管调零，读取各管吸光度。
（三）计算
1.计算10次测定的平均吸光度及标准差。
2.计算最低检测限：平均吸光度+3S
3.将吸光度值转换成浓度单位。 LLD=A低/A标×C标
三、线性范围试验
可报告范围（RR）：指可以报告的所有
结果的范围，包含两种类型的范围，即 分析测量范围和临床可报告范围。
分析测量范围（AMR）：指分析样 本未经任何预处理（稀释、浓缩等），
由检测系统直接测量得到的待测物的可
靠结果范围，在此范围内一系列不同浓
度的样本分析物的测量值与其实际浓度
（真值）呈线性比例关系。
第二次实验 血清总蛋白测定、
最低检出限 线性范围试验
教学要求与目的
1.掌握血清总蛋白测定原理和测定方
法，了解其临床意义。 2.掌握最低检出限、线性范围的定义、 评价方法及用途。 3.熟悉最低检出限、线性范围的实验 方法。
教学内容 1.双缩脲法测定血清总蛋白。 2.最低检出限测定。
3.线性范围试验。
25.9 43.2 72.0 120.0
2.按下表操作
（ul） B S 20 20 1000 1000 1000 20 1000 20 1000 20 1000 U1 U2 U3 U4.......U7
DH2O 20
标准液 血清 试剂
各测定管均测定双份，混匀，37℃ 水浴10分钟，在540nm波长处，用空白
B （ul） DH2O 20 标准液 血清 双缩脲试剂 1000 S U
20 1000
20 1000
混匀，37℃水浴10分钟，在540nm波长 处，用空白管调零，读取各管吸光度。
3、计算
血清总蛋白(g/L) = 测定管吸光度
标准管吸光度
× 蛋白标准液浓度
（50g/L）
参考值：60－83g/L
（四）注意事项 1.严重溶血和黄疸可使测定结果偏高,可
2.蛋白浓度降低 （1）蛋白丢失：如肾病综合征。 （2）摄入不足：营养不良。 （3）蛋白质合成障碍：如肝脏疾病。
二、最低检测限试验
检测限（LoD）：是检测系统可检测出
的最低分析物浓度。
最低检测限（LLD）：指当标本中
不含有待测分析物时，反应响应量可
能出现的数值范围，即单次测量可达
到的非空白检测响应量对应的分析物
管调零，读取各管吸光度。
（四）记录实验数据，并绘制剂量反应
曲线。以总蛋白浓度预期值为横坐标， 测定值为纵坐标，在坐标纸上绘制曲线，
即为剂量反应曲线。
（五）评价
1.目测法：是评估几个不同浓度样本
的多次测量均值与实际值之间是否具有
肉眼上的直线关系。没有用到统计学方
法来验证线性。
2.平均斜率法：是采用最小二乘法直线
作标本空白管消除。
2.脂肪乳糜干扰比色，可加丙酮离心。 3.右旋糖酐可使测定产生混浊影响结果。
（五）方法学评价 1.精密度较好、准确度较高，WHO
推荐方法。
2.线性范围宽（10-120g/L）。
3.操作简便你、快速，成本低廉。 4.灵敏度较低。
（六）临床意义
1.蛋白浓度升高
（1）血液浓缩：脱水、外伤性休克等。 （2）蛋白质合成增加：多发性骨髓瘤、 免疫增殖病等。
（二）试剂 1.蛋白质标准液（50g/L） 2.混合血清（120g/L）
3.双缩脲试剂1.制备Fra bibliotek同浓度的样本U1 DH2O（ul） 200 血清（ul） 300 浓度（g/L) 5.6 U2 200 300 9.3 U3 200 300 15.6 U4 200 300 U5 200 300 U6 200 300 U7
度或低浓度处的实测值和预期值间有较 大偏差。试着舍去某组数据，另作回归 分析，直到a接近于0，b在0.97~1.03之间， 此时缩小的分析范围是真实的可报告范 围。
3.用统计软件拟合（了解）
最佳拟合曲线与直线方程的平均偏差
＜5%的浓度范围为该方法的线性范围。
下次课内容
1.血清白蛋白测定。 2.回收试验。
一、血清总蛋白测定 凯氏定氮法 参考方法 双缩脲法 常规方法 酚试剂法 染料结合法 浊度法、紫外光谱法
（一）实验原理
血清中蛋白质分子中的肽键在碱性溶液
中能与Cu2+作用生成稳定的紫红色络合
物，此反应和两个尿素分子缩合后生成
的双缩脲在碱性溶液中与铜离子作用形
成紫红色的反应相似，故称双缩脲反应。
蛋白质 + Cu
回归作统计分析方法。以总蛋白浓度预 期值为横坐标，测定值为纵坐标，在坐
标纸上作图，若所有实验点在坐标纸上
呈明显直线趋势，
建立回归方程y=a+bx，要求a接近于0，
b在0.97~1.03之间，若满足此条件，则可
直接判断该测定方法是否在所要求的线 性范围。
若a较大，b>1.03或<0.97则认为在高浓
临床可报告范围（CRR）：指定量
检测项目向临床能报告的检测范围，患
者样本可经稀释、浓缩或其它预处理。
（一）原理 线性范围是指系统最终输出值（浓度
或活性）与被分析物浓度或活性成比例
的范围。线性范围的测定即测定浓度曲
线接近直线的程度，它反映整个系统的
输出特征。
本试验使用不同浓度的总蛋白标准溶
液，用双缩脲试剂测定各自的浓度，以 标准液预期浓度为横坐标，测得浓度为 纵坐标，在坐标纸上作图，即可绘制出 一条直线，即计量反应曲线。
量。
功能灵敏度（FS）：以日间重复CV
为20%时对应检测限样品具有的平均浓 度确定为检测系统或方法可定量报告的 分析物的最低浓度或其它量值 。
（一）原理
选择合适的空白标本，该标本与待测 标本的区别在于不含有待测物质，一般
用处理过的标本或一般标本，在分析步
骤中省去关键试剂或操作。
本次实验采用蒸馏水作为空白标本，采 用双缩脲法进行多次测定，求出吸光度 的均值及标准差，计算最低检测限。
2+ OH
紫红色络合物
在540nm波长处有吸收峰，在一 定浓度范围内其吸光度增加与蛋白含 量成正比，由此可求得蛋白质含量。
（二）实验试剂
1、双缩脲试剂
氢氧化钠、酒石酸钾钠
硫酸铜、碘化钾 2、标准液 总蛋白 50g/L
（三）操作方法 1、操作参数： 波长：540nm 温度：37℃
测定模式：终点法
2.操作步骤
（二）操作步骤
（ul） B S 20 U（1----10）
DH2O
标准液
20
双缩脲试剂 1000 1000 1000 混匀，37℃水浴10分钟，在540nm波长处， 用空白管调零，读取各管吸光度。
（三）计算
1.计算10次测定的平均吸光度及标准差。
2.计算最低检测限：平均吸光度+3S
3.将吸光度值转换成浓度单位。 LLD=A低/A标×C标
三、线性范围试验
可报告范围（RR）：指可以报告的所有
结果的范围，包含两种类型的范围，即 分析测量范围和临床可报告范围。
分析测量范围（AMR）：指分析样 本未经任何预处理（稀释、浓缩等），
由检测系统直接测量得到的待测物的可
靠结果范围，在此范围内一系列不同浓
度的样本分析物的测量值与其实际浓度
（真值）呈线性比例关系。
第二次实验 血清总蛋白测定、
最低检出限 线性范围试验
教学要求与目的
1.掌握血清总蛋白测定原理和测定方
法，了解其临床意义。 2.掌握最低检出限、线性范围的定义、 评价方法及用途。 3.熟悉最低检出限、线性范围的实验 方法。
教学内容 1.双缩脲法测定血清总蛋白。 2.最低检出限测定。
3.线性范围试验。
25.9 43.2 72.0 120.0
2.按下表操作
（ul） B S 20 20 1000 1000 1000 20 1000 20 1000 20 1000 U1 U2 U3 U4.......U7
DH2O 20
标准液 血清 试剂
各测定管均测定双份，混匀，37℃ 水浴10分钟，在540nm波长处，用空白
B （ul） DH2O 20 标准液 血清 双缩脲试剂 1000 S U
20 1000
20 1000
混匀，37℃水浴10分钟，在540nm波长 处，用空白管调零，读取各管吸光度。
3、计算
血清总蛋白(g/L) = 测定管吸光度
标准管吸光度
× 蛋白标准液浓度
（50g/L）
参考值：60－83g/L
（四）注意事项 1.严重溶血和黄疸可使测定结果偏高,可
2.蛋白浓度降低 （1）蛋白丢失：如肾病综合征。 （2）摄入不足：营养不良。 （3）蛋白质合成障碍：如肝脏疾病。
二、最低检测限试验
检测限（LoD）：是检测系统可检测出
的最低分析物浓度。
最低检测限（LLD）：指当标本中
不含有待测分析物时，反应响应量可
能出现的数值范围，即单次测量可达
到的非空白检测响应量对应的分析物
管调零，读取各管吸光度。
（四）记录实验数据，并绘制剂量反应
曲线。以总蛋白浓度预期值为横坐标， 测定值为纵坐标，在坐标纸上绘制曲线，
即为剂量反应曲线。
（五）评价
1.目测法：是评估几个不同浓度样本
的多次测量均值与实际值之间是否具有
肉眼上的直线关系。没有用到统计学方
法来验证线性。
2.平均斜率法：是采用最小二乘法直线
作标本空白管消除。
2.脂肪乳糜干扰比色，可加丙酮离心。 3.右旋糖酐可使测定产生混浊影响结果。
（五）方法学评价 1.精密度较好、准确度较高，WHO
推荐方法。
2.线性范围宽（10-120g/L）。
3.操作简便你、快速，成本低廉。 4.灵敏度较低。
（六）临床意义
1.蛋白浓度升高
（1）血液浓缩：脱水、外伤性休克等。 （2）蛋白质合成增加：多发性骨髓瘤、 免疫增殖病等。
（二）试剂 1.蛋白质标准液（50g/L） 2.混合血清（120g/L）
3.双缩脲试剂1.制备Fra bibliotek同浓度的样本U1 DH2O（ul） 200 血清（ul） 300 浓度（g/L) 5.6 U2 200 300 9.3 U3 200 300 15.6 U4 200 300 U5 200 300 U6 200 300 U7
度或低浓度处的实测值和预期值间有较 大偏差。试着舍去某组数据，另作回归 分析，直到a接近于0，b在0.97~1.03之间， 此时缩小的分析范围是真实的可报告范 围。
3.用统计软件拟合（了解）
最佳拟合曲线与直线方程的平均偏差
＜5%的浓度范围为该方法的线性范围。
下次课内容
1.血清白蛋白测定。 2.回收试验。
一、血清总蛋白测定 凯氏定氮法 参考方法 双缩脲法 常规方法 酚试剂法 染料结合法 浊度法、紫外光谱法
（一）实验原理
血清中蛋白质分子中的肽键在碱性溶液
中能与Cu2+作用生成稳定的紫红色络合
物，此反应和两个尿素分子缩合后生成
的双缩脲在碱性溶液中与铜离子作用形
成紫红色的反应相似，故称双缩脲反应。
蛋白质 + Cu