PMA体外诱导小鼠多能干细胞向心肌细胞的分化
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PMA体外诱导小鼠多能干细胞向心肌细胞的分化
李晓莉;丁璐;陈炎;欧东波;曾迪;郑强荪
【摘要】目的研究丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)对小鼠诱导多能干细胞体外分化为心肌细胞的影响,以建立一种高效安全的体外诱导iPSC分化为心肌细胞的实验方法.方法用悬滴法形成拟胚体(EBs),PMA诱导其向心肌细胞定向分化.免疫细胞学标记检测心肌肌钙蛋白T(cTnT)和α横纹肌辅肌动蛋白(α-actinin)的表达;RT-PCR和q-PCR检测Brachyury,cTnT,MLC2a,NKX2.5和GATA4等mRNA的表达.以添加相应DMSO作为对照组,观察各组出现搏动拟胚体的数量,计算分化比率.结果PMA 诱导小鼠诱导多能干细胞分化为心肌细胞的最佳浓度为100 nmol/L,此时拟胚体搏动率可达53%,显著高于对照组(12%),且PMA诱导产生的心肌细胞表达多种心肌蛋白及基因,具有心肌细胞的结构特征.结论 PMA能够促进miPSC在体外定向分化为心肌样细胞.
【期刊名称】《基础医学与临床》
【年(卷),期】2015(035)004
【总页数】7页(P463-469)
【关键词】多能干细胞;心肌细胞;丙二醇甲醚醋酸酯;分化
【作者】李晓莉;丁璐;陈炎;欧东波;曾迪;郑强荪
【作者单位】第四军医大学唐都医院心血管内科,陕西西安710038;第四军医大学唐都医院心血管内科,陕西西安710038;第四军医大学唐都医院心血管内科,陕西西安710038;第四军医大学唐都医院心血管内科,陕西西安710038;第四军医大学唐
都医院心血管内科,陕西西安710038;第四军医大学唐都医院心血管内科,陕西西安710038
【正文语种】中文
【中图分类】Q254
目前人工生物心脏被认为是一种治疗心脏损伤最有希望的途径和方式,但体外构建人工生物心脏,必须制备大批量、同质性心肌细胞。
原代心肌细胞由于其极低的增殖能力,无法满足大批量制备的要求;而干细胞来源的心肌细胞则成为解决这一难题的最好选择[1]。
但多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSC)在体外
自然分化为心肌细胞的能力较低,因此寻找一种有效的诱导方法具有重要意义。
丙二醇甲醚醋酸酯(Phorbol- 12-myristate- 13-acetate, PMA)作为一种蛋白激酶C 通路的激活剂,具有促进细胞增殖以及心肌肥大的作用,且目前已有研究表明PMA 可以诱导脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)分化为心肌细
胞[2- 4]。
但PMA是否具有促进iPSC向心肌细胞分化的作用却鲜有报道。
不同种类的细胞有明显的异质性,相同诱导刺激在不同细胞会表现出不同诱导效应,因此对于PMA在多能干细胞的诱导效应还需进一步研究。
本实验研究PMA对小鼠诱导多能干细胞(mouse induced pluripotent stem cells, miPSC)体外分化为心肌
细胞的影响,以期建立一种高效安全的体外诱导iPSC分化为心肌细胞的实验方法。
1.1 材料
1.1.1 实验细胞和动物来源:小鼠诱导多能干细胞(miPSC)(中科院广州生物医药与健康研究院裴端卿教授),该细胞带有表达绿色荧光的OCT4基因,在未分化时表达
绿色荧光,随着分化的进行荧光量减少,据此可以跟踪细胞的分化状态。
西安交通大学医学部实验动物中心SPF级ICR小鼠:体质量18~22 g(许可证号:
SCXK(陕)2012- 003)。
1.1.2 主要试剂:KnockOutTM-DMEM培养基、KnockOutTM血清替代品和TRizol(Invitrogen 公司);高糖DMEM培养基、谷氨酰胺衍生物、非必需氨基酸、PBS、胎牛血清和0.5% Trypsin-EDTA(Gibco公司);丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)、B-巯基乙醇、Trixon-100、多聚甲醛和丝裂霉素C(Sigma公司);白血病抑制因
子(LIF, Chemicon公司);抗体心肌肌钙蛋白T(cardiac Troponin T, cTnT)和α横纹肌辅肌动蛋白(α-Sarcomeric actinin, α-actinin) (Abcam 公司);RT-PCR试剂盒(Promega公司);牛血清白蛋白(西安国安生物科技公司)。
1.2 方法
1.2.1 培养溶液配制:胚胎成纤维细胞培养基配置:90%高糖DMEM培养基+10%胎牛血清+0.1 mmol/L非必需氨基酸+2 mmol/L谷氨酰胺的衍生物; miPSC 细胞培养基配制:85% KnockOutTM-DMEM培养基+15% KnockOutTM血清替代
品+0.1 mmol/L非必需氨基酸+2 mmol/L谷氨酰胺的衍生物+0.1 mmol/L β-巯
基丙醇+1 000 U/mL白血病抑制因子; miPSC心肌分化培养基配制:80%高糖DMEM培养基+20%胎牛血清+0.1 mmol/L非必需氨基酸+2 mmol/L谷氨酰胺
的衍生物。
1.2.2 小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的制备:实验选用怀孕13.5 d的ICR小鼠,分离
获得小鼠胚胎成纤维细胞,具体方法见参考文献[5]。
1.2.3 miPSC的培养及诱导分化:复苏miPSC,以4×105个/皿的细胞密度接种到
处理好的MEF饲养层中,37 ℃孵育培养。
将状态较好且未分化的miPSC 细胞用0.05%胰蛋白酶细胞消化液消化为单个细胞,差速贴壁去除饲养层细胞,收集、计数。
用miPSC 心肌分化培养基配成细胞密度为(2~3)×104个/mL的细胞悬液,
以20 μL/滴,滴至培养皿上盖内表面,悬滴培养3 d形成肉眼可见的白色颗粒状
物体(拟胚体)。
然后用滴管吸取拟胚体接种于0.1%明胶覆盖的培养皿中,在贴壁2~6 d,加入含不同浓度PMA(1、5、10 20、50 100、150和200 nmol/L)的
miPSC心肌分化培养基, 以添加DMSO作为对照组, 比较各组之间心肌细胞的诱
导效率(图1)。
1.2.4 免疫细胞化学染色:miPSC诱导分化15 d后,消化传代,种于载玻片上贴
壁24 h,进行免疫荧光染色,具体步骤见参考文献[6]。
一抗浓度cTnT(1∶200)、α-actininn(1∶200)。
1.2.5 RT-PCR鉴定:为了动态检测miPSC 细胞向心肌分化的过程,诱导组细胞在分化-3、0、1、3、5、7、9、12和15 d用Trizol提取总RNA,测定RNA浓度,以总体积20 μL, RNA样品1 μg的体系,参照试剂盒(oligo(dT)18 primer and a RevetAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit)反应条件进行反转录合成cDNA, 进行PCR测定多能性标志基因OCT4、Nanog,中胚层标志基因Brachyury和心肌细胞标志基因cTnT、GATA4、NKX2.5 MLC2v和MLC2a的表达。
PCR 引物
序列见表1。
1.2.6 Quantitative real-time PCR测定:在分化第2~6 d加入
100 nmol/L PMA和相应DMSO,分化第15天收集细胞提取RNA, 反转录合成cDNA。
参照试剂盒(Thermo Scientific Maxima SYBR Green qPCR Master Mixes)进行q-PCR测定诱导组和对照组心肌特异性基因的表达情况。
以GAPDH
作为对照,通过2-ΔΔCt算法进行分析。
1.3 统计学分析
本实验组间数据比较采用均数±标准差±s)表示, 应用SPSS13.0软件进行分析,组间比较采用t检验。
2.1 miPSC形态观察及鉴定
明胶上miPSC与胚胎干细胞 (embryonic stem cell, ESC) 细胞形态相类似,细胞呈集落样生长、集落致密且边缘整齐、细胞形态较小、核质比高、增殖迅速、倍增时间短。
绿色荧光蛋白转基因(OCT4)小鼠来源的miPSC在荧光显微镜下观察, 呈
现出与光学显微镜对应的集落状绿色细胞团(图2)。
2.2 EB分化过程形态学观察
miPSC 悬滴培养3 d,形成拟胚体后,进行贴壁诱导分化。
随着拟胚体的不断分化,两组圆形拟胚体逐渐平铺生长,在边缘也出现圆球形、梭型或多边形细胞,细胞间交织成网,逐渐形成细胞团(簇)(图3)。
在贴壁诱导第7天,诱导组观察到自
发搏动的细胞团,而对照组到贴壁诱导第9天才观察到有自发搏动细胞团的出现,且在诱导分化12 d时,各组搏动细胞团数均达到峰值,其后各组搏动细胞团数未见增加。
2.3 优化PMA最佳诱导浓度
在贴壁诱导第2~6天,添加不同浓度PMA(0~200 nmol/L),比较了分化12 d
时各组之间EB的搏动率。
在0~100 nmol/L浓度区间内,PMA的诱导分化率随浓度增加而增加,在PMA浓度达到100 nmol/L 时达到峰值,之后随PMA浓度增加其诱导效率开始下降;PMA诱导miPSC 向心肌细胞分化的最佳浓度为100 nmol/L,且在PMA浓度20~200 nmol/L浓度区间内,PMA的诱导分化形成的心肌细胞的搏动率均显著高于对照组(图4)。
2.4 q-PCR检测对照组与诱导组心肌基因的表达
在分化2~6 d加入100nmol/L PMA和相应DMSO,在分化15 d时诱导组心肌特异性基因cTnT、NKX2.5、GATA4、MLC2c和MLC2a的表达均显著高于对照组(图5)。
2.5 免疫荧光染色
miPSC诱导分化15 d,分化形成的心肌细胞胞质中cTnT、α-Sarcomeric actinin表达阳性,且呈现出的清晰的肌丝和肌节结构(图6)。
2.6 RT-PCR检测心肌分化期间各基因的表达情况
miPSC在PMA的作用下,随着分化进行干细胞标志基因OCT3/4和Nanog的
表达均不断减少;中胚层标志基因Bracyury在分化第3天时出现表达,随后减弱
消失。
而心肌细胞标志基因cTnT等均在第5天均出现表达,随后逐渐增强(图7)。
iPS细胞是近年来通过体细胞重编程获得的类似于胚胎干细胞的诱导多能干细胞。
与胚胎干细胞不同,iPS细胞由于避免了胚胎干细胞所带来的伦理及免疫排斥问题,相较于胚胎干细胞更具临床应用价值。
但iPS细胞本身带有其原始细胞的部分记忆效应,其体外分化为其他细胞的能力弱于胚胎干细胞。
寻求高效稳定的分化方法成为诱导干细胞定向分化为心肌细胞的一个重要研究方向。
目前体外促进干细胞向心肌细胞分化的方法有很多,包括化学诱导剂、共培养等[7- 9],而化学诱导剂由于价格低廉,剂量浓度易于控制,成为了最为常用的诱导方法,目前运用较多的化学诱导剂如二甲基亚砜[10]、5-氮胞苷[11]、维生素C[12]、wnt信号分子[13]。
PMA作为一种蛋白激酶C通路的激活剂,具有促进细胞增殖以及心肌肥大的作用,且目前已有研究表明PMA可以诱导ADSCs分化为心肌细胞,但是对其是否具有
促进多能干细胞向心肌细胞分化的作用却鲜有报道。
不同种类的细胞有明显的异质性,相同诱导刺激在不同细胞会表现出的不同诱导效应,若直接将适用于ADSCs
细胞的方案应用到miPSC 上是有困难的,因此对于PMA在多能干细胞的诱导效
应还需进一步研究。
本实验以PMA为诱导剂,研究了其对小鼠诱导多能干细胞体外分化为心肌细胞的影响。
研究发现,在分化2~6 d时添加PMA,诱导组自发搏动细胞团出现较对
照更早,且搏动数量显著高于对照。
PMA浓度分析结果发现,PMA最佳诱导浓
度为100 nmol/L,此时心肌细胞诱导效率高达53%,且PMA浓度在20~200 nmol/L范围内,其分化效率与对照相比显著增加。
q-PCR结果也表明心肌特异性标志基因Nkx2.5, GATA4, cTnT, MLC2a和MLC2c在诱导组的表达均高于对照组。
免疫细胞化学技术结果显示, 分化得到的心肌细胞表达心肌特异蛋白cTnT和
α-actinin,且呈现出的清晰的肌丝和肌节结构。
RT-PCR研究表明PMA诱导分化miPSC,在第3天分化形成中胚层,第5天即分化形成心肌细胞,随后其心肌细
胞逐渐增加。
综上所述,PMA可以促进小鼠诱导多能干细胞体外分化为心肌细胞,显著提高miPSC 向心肌细胞分化的效率,建立了一种高效安全的体外诱导miPSC分化为心肌细胞的实验方法,为构建具有心肌组织特性和收缩功能的人工心肌打下基础。
志谢:感谢中科院广州生物医药与健康研究院裴端卿教授提供小鼠诱导多能干细胞。
健康生活可抗衰老
据英国《BBC新闻》(BBC NEWS)2013年9月18日报道,一项小型研究证实,
健康生活方式有助人体细胞抗衰老。
包括食用以植物为主的未加工健康食品(whole food)、每日适度运动、做瑜伽放松身体及减轻压力。
研究对象为35名男子,要求其中10人遵从这样的生活方式;另外25人没有要
求他们改变生活方式。
在饮食和每日身心锻炼活动以外,这10人每周还参加由专家设计的加强新技巧课程,为期3个月。
经过5年后,科学家评量参与研究人员的细胞老化标记,也就是“端
粒”(telomere)。
这个位于染色体末端的蛋白质可在细胞分裂时协助保护DNA链。
端粒的长度与细胞的寿命有关。
在10人小组里,端粒的长度在5年内平均增加达10%,且严谨遵从新生活方式的参与者增加最多。
但对照组中端粒的长度平均缩
短3%。
领导这项研究的加利福尼亚大学旧金山分校(UCSF)教授欧尼希(Dean Onish)说:“如经大规模随机控制实验证实此研究结果,广泛生活方式改变可能大幅降低许多疾病和早逝的风险。
”
此研究刊登于《柳叶刀·肿瘤学》(The Lancet Oncology)期刊上。
DNA修复机制展现治癌新契机
据英国《BBC新闻》(BBC NEWS)2013年9月12日报道,一个跨国团队合作研
究发现,PIF1解旋酶可解开DNA双螺旋,有效地帮助DNA复制,达到基因修复功能。
研究人员认为,了解PIF1解旋酶修复DNA作用机制,对药物与临床应用
会有很大帮助,希望能从基础研究带到癌症应用。
同源重组(homologous recoombination)是基因修复非常重要的机制,同源重组过程中,PIF1解旋酶能有效地解开DNA双螺旋,协助DNA聚合酶进行DNA复制及完成断裂DNA的修复。
研究团队利用酵母菌进行实验发现,在正常PIF1解
旋酶存在情况下,酵母菌可以很有效地修复细胞DNA损伤,但如果PIF1解旋酶
突变,修复效果就大幅降低。
2011年一项研究显示,在不使用药物情况下,抑制癌细胞的PIF1解旋酶可使癌
细胞生存率降低10倍。
使用化疗药“健泽”后,癌细胞中存有正常PIF1解旋酶,对药物忍受度较高,PIF1解旋酶被抑制住,癌细胞则显著死亡,显见抑制PIF1解旋酶可抑制癌细胞生长。
研究人员认为,研究提供了PIF1解旋酶作用机制,未来希望能用来筛查癌症患者、发展标靶药物治疗癌症,也希望能建立药物筛查平台,发展PIF1抑制剂。
这项研究是第一次结合遗传学与生物化学找出PIF1解旋酶参与DNA修复以及作
用机制。
研究结果刊登在《自然》(Nature)期刊上。
【相关文献】
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