褶纹冠蚌热休克蛋白HSP7O基因的克隆及表达研究

褶纹冠蚌热休克蛋白HSP7O基因的克隆及表达研究
谢彦海;胡宝庆;文春根
【摘要】The sequences of HSP70 cDNA were cloned from the haemocytes of freshwater mussel Cristaria plicata using degenerate primers to integrate the reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). The Semi-quantitative PCR method was applied to further study the HSP70 mRNA expression in various tissues of C. Plicata. The results revealed that the HSP70 cDNA clone consisted of 2664bp(Gen-Bank accession number: ADM64336)with a 5'-untranslated region (UTR) of 364 bp and a 3'-UTR of 383 bp. The open reading frame of Hsp70 was 1917 bp and intronless,. The ORF encoded a putative protein of 638 amino acids with a predicted molecular mass of 70. 3 kDa0 The theoretical isoelectric point of the protein is 5. 61. There were three HSP70 family signatures,I. E. JDLGTTYS (residues 10-17) , VFDLGGGT-FDVSIL (198-211), VVLVGGSTRIPKVQK (336-350). The deduced amino acid sequence of HSP70 shared high identities with the HSP70s of Mytilus galloprovincialis and Crassostrea virginica, with 79. 47% and 77% autoploidy respectively. The expression of HSP70 mRNA was all detectable in blood,mantle, gill, muscles and hepatopancreas in common situation. Challenge of Cristaria plicata with heat shock(35 "O or the pathogenic bacteria Aeromonas hydrophila resulted in a dramatic increase in the expression of HSP70 mRNA level in these tissues. The expression of HSP70 in hemocytes and gills by the heat shock treatment increased in the most significant,while in gills and muscles,the most
significant rise of the expression of HSP70 is by injection A. Hydrophila.%运用兼并引物结合RT-PCR方法从褶纹冠蚌(Cristaria plicata)血细胞中克隆出热休克蛋白70(HSP70)的cDNA序列.用半定量PCR方法研究了HSP70 mRNA在褶纹冠蚌不同组织的表达情况.结果表明:HSP70cDNA全长为2664 bp,5’非编码区364个核苷酸,3’非编码区383个核苷酸,开放阅读框为1917 bp,编码638个氨基酸组成的蛋白质,该蛋白理论等电点为5.61,分子量为70.3 kD.HSP70基因不含内含子.氨基酸序列分析发现,推导的氨基酸序列含有HSP70家族的3个标签序列(I10 DLGTTYS17,V198 FDLGGGTFDVSIL211和V336VLVGGSTRIPKV QK350).氨基酸序列同源性比较显示HSP70与紫贻贝(Mytihcs galloprovincialis)和美洲牡蛎(Crassostrea virginica)氨基酸序列同源性分别为79.47％和77％.半定量PCR分析显示在正常褶纹冠蚌血液、外套膜、鳃、闭壳肌和肝胰腺5种组织中均能检测到HSP70的基因表达.经过热休克或病原菌刺激后,蚌各组织中HSP70 mRNA的表达显著增加,其中热休克处理后,蚌的鳃和血液中HSP70 mRNA表达量增加最为显著；而嗜水气单胞菌刺激后蚌的肌肉和鳃组织中HSP70 mRNA表达量增加最明显.
【期刊名称】《南昌大学学报（理科版）》
【年(卷),期】2011(035)005
【总页数】7页(P457-463)
【关键词】褶纹冠蚌、热休克;HSP70、表达;嗜水气单胞菌
【作者】谢彦海;胡宝庆;文春根
【作者单位】南昌大学生物科学系,江西南昌 330031;南昌大学实验动物科学部,江西南昌 330031;南昌大学生物科学系,江西南昌 330031;南昌大学生物科学系,江
西南昌 330031
【正文语种】中文
【中图分类】Q959.215
热休克蛋白（Heat shock protein，HSP）是一种普遍存在于所有生物体内的可
溶性的细胞内蛋白，它是一种高度保守的蛋白，从原核生物到真核生物具有很高的同源性［1］。

大部分的热休克蛋白都是组成形表达，然而其表达受各种生理紊乱或者应激因子的正调节，这些应激因子包括高温、活性氧离子、有毒物质、微生物感染以及其它的应激因子，包括蛋白质变性等。

热休克蛋白超家族可以根据序列的同源性和分子量的大小分为：HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40 和小HSP 家族［2］。

其中HSP70家族包含有分子量接近的一类相关蛋白、如HSP70、HSC70、HSP72、HSP75 和 GRP78［3］，HSP70也是研究最深入的一种热休
克蛋白，其分子生物学功能主要是分子伴侣作用、抗氧化作用、参与机体免疫作用、抑制细胞凋亡作用等［1］。

目前，已经成功克隆出多种海洋贝类的热休克蛋白70的cDNA序列［4－8］，
并对该蛋白基因的功能进行了研究。

但淡水贝类的热休克蛋白及其功能研究并未见报道。

褶纹冠蚌（Cristaria plicata）作为重要的淡水育珠蚌之一，在育珠生产过
程中，容易遭受病原微生物侵袭。

因此，本文采用RACE方法对褶纹冠蚌HSP70
基因进行克隆，利用RT－PCR方法研究HSP70在蚌各组织的表达。

以期为研究
蚌的免疫机制提供理论基础。

褶纹冠蚌采自鄱阳湖，体长18～24 cm，暂养于水族箱中，不断充气，3 d后开
始实验。

实验用蚌置于35℃水族箱内热休克处理1 h，再将蚌放回到20℃±2水
中恢复2 h。

用10 m L注射器从蚌后闭壳肌血窦中抽取血液10 m L；4℃，3
600 rpm离心10 min，弃上清，获得血细胞沉淀［9］，用于总RNA的提取。

1．2．1 总RNA的提取及cDNA第一链的合成
采用Invitrogen公司的Trizol法从蚌全血细胞中提取总RNA。

RNA的完整性用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，再用紫外分光光度计进行定量及纯度分析。

取1μg 总RNA利用Clontech公司的Power－Script TM Reverse Transcriptase进行cDNA第一链的合成。

1．2．2 HSP70 cDNA中间片段序列的获得根据已知的软体动物紫贻贝（Mytilus galloprovincialis）、香港巨牡蛎（Crassostrea hongkongensis）和九孔鲍（Haliotis diversicolor）热休克蛋白HSP70基因的保守序列，设计褶纹
冠蚌HSP70基因的简并引物HSP70F1和HSP70R1（表1）。

以c DNA第一链
为模板，采用r TaqDNA聚合酶（Takara公司），进行中间片段的扩增，PCR反应采用25μL体系，扩增条件为：94℃5 min，94℃30 s，56℃30 s，72℃60 s，32个循环；72℃延伸10 min。

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，用Tiangen公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段后，连接到p MD18－T克隆载体中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经检测后将阳性克隆送测序。

1．2．3 HSP70基因3’末端和5’末端的克隆采用Smart RACE PCR技术，利用巢式PCR方法进行3’末端和5’末端克隆，根据已克隆出的中间片段设计出3’RACE引物：HSP70－3out和 HSP70－3in；5’RACE 引物：HSP70－5out 和 HSP70－5in。

参照SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒方法，RACE通用引物采用试剂盒中的Long引物和Short引物。

将Long引物与Short 引物按比例混合为通用引物UPM。

3’末端克隆采用HSP70－3out与UPM引物进行PCR扩增。

PCR反应条件为：94℃5 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃80 s，32循环；72℃ 延伸10 min，将第一轮PCR产物稀释50倍用作第二轮PCR的模
板。

第二轮PCR用 HSP70－3in引物与通用引物 UPM 进行PCR扩增，PCR反
应条件同第一轮PCR条件。

5’末端克隆先采用HSP70－5out引物与通用引物UPM进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃5 min；94℃30 s，72℃150 s，5循环；94℃30 s，70℃30，72℃2 min，5循环；94℃30 s，68℃30 s，72℃60 s，28循环；72℃10 min。

将第一轮PCR产物稀释50倍用作第二轮PCR的模板。

第二轮PCR用 HSP70－
5in引物与通用引物 UPM 进行PCR扩增，PCR反应条件同第一轮PCR条件。

将所得第一和第二轮PCR产物分别切胶回收，连接入p MD18－T克隆载体中，转
化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆送测序。

1．2．4 测序及序列分析运用DNAMAN软件，将中间片段、3’RACE和
5’RACE测序所得序列进行比对拼接。

用 ExPASy 网站（http：／／expasy．pku．edu．com）上的软件进行序列分析（开放阅读框搜索、氨基酸序列的推断等），用BLAST搜索同源基因，SignalP3．0分析信号肽序列（http：
／／www．cbs．dtu．dk／services／SignalP／）。

保守序列分析用CDART （http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／Structure／lexington／lexington．cgi）软件进行。

与其他动物HSP70氨基酸序列同源性比较通过Clustal W1．83软件进行。

基于
氨基酸序列构建的系统进化树采用Mega 4．0软件的邻接法建立，并采用自展法（Bootstrap Method）对其可靠性进行分析验证（1 000个假重复数）。

进化树中每个序列的名称及其简称和GenBank的序列登录号（表2）。

1．2．5 褶纹冠蚌基因组的提取用Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver．3．0（Takara公司）提取褶纹冠蚌全血细胞基因组。

用一次性注射器从蚌
后闭壳肌血窦内抽取血淋巴10 m L，4℃，3 000 rpm离心10 min，收集血细胞。

按试剂盒说明书步骤进行DNA提取。

DNA的完整性用1%琼脂糖凝胶电泳进行
检测，并保存在－20℃冰箱备用。

1．2．6 褶纹冠蚌热休克蛋白（HSP70）基因全长克隆根据已获得的HSP70基
因的cDNA序列设计特异引物70－Forward和70－Reverse，以蚌基因组DNA 为模板，扩增蚌HSP70基因全长。

采用50 μL反应体系，用La TaqDNA聚合酶（Takara公司）进行PCR反应。

PCR反应条件为：94℃5 min，94℃45 min，55 ℃ 45 min，72 ℃ 3 min，38循环，72℃10 min，将所得产物切胶回收，连
接入p MD18－T克隆载体，转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆
测序。

1．2．7 热休克（35℃）诱导后蚌各组织 HSP70基因的表达各选取大小均匀的
5个蚌作为实验组和对照组，实验组蚌的热休克处理方法与1．1相同。

对照组为
常温（20℃±2）养殖的蚌，然后迅速从实验组和对照组蚌中分别取血细胞、肝胰腺、鳃、外套膜、闭壳肌组织，分别用Trizol法提取总RNA，反转录成cDNA第一链。

根据HSP70基因序列设计半定量表达引物HSP70BF和HSP70BR，预计扩增产
物为321 bp。

PCR反应为25μL体系。

PCR条件为：94℃5 min；94℃30 s，50℃30 s，72 ℃ 90 s，35循环；72 ℃ 10 min。

以β－actin基因作为内参基因，其引物分别β－actinF和β－actinR。

预计扩增产物370 bp，PCR扩增条件为：94℃5 min；94℃30 s，53℃30 s，72℃90 s，30循环；72℃10 min。

PCR产
物用1%的琼脂糖凝胶电泳分析，拍照。

反应产物电泳条带的亮度强弱指示mRNA表达的高低。

通过Quantity One软件计算目的条带和β－actin条带的光密度比值，结果用SPSS13．0软件的T－text检验分析。

1．2．8 嗜水气单胞菌刺激后蚌各组织HSP70基因的表达各选取大小均匀的15
个蚌作为实验组和对照组，将嗜水气单胞菌接入LB液体培养基中扩大培养8 h左右，于5 000 rpm离心10 min，弃上清，然后用灭菌的PBS悬浮菌体细胞。

调
整菌液浓度约为1×108个／m L。

实验组分别用一次性注射器从蚌闭壳肌注射0．5 m L嗜水气单胞菌菌液；对照组注射等量的PBS，后放回水族箱中，不间断充氧暂养。

分别于0、6，12、24，48 h时间段取3只蚌的血液、肝胰腺、鳃、
外套膜、闭壳肌组织，用Trizol法提取总RNA，再反转录成cDNA，最后将其稀释成相同的浓度，进行普通PCR反应，反应条件和接下来步骤同1．2．7。

结果
处理同上。

褶纹冠蚌HSP70基因c DNA全长为2 664 bp（GenBank登录号：
ADM64336），5’非编码区364 bp，3’非编码区383 bp，开放阅读框为1 917 bp，编码638个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白理论等电点为5．61，分子量为70．3 k D。

通过氨基酸序列分析发现，该蛋白含有HSP70家族的3个标签序列（I10 DLGTTYS17， V 198 FDLGGGTFDVSIL211， V 336 VLVGGSTRIPKV QK350）。

ATP 酶结构域（4－383），底物肽结合结构域（387－545），C端
结构域（539－620）。

以及4个糖基化位点（N36，N362，N387，N489）。

以全血基因组DNA为模板，从基因组中扩增HSP70基因全长，结果经测序鉴定，得到2 026 bp大小的片段，与用相同引物扩增的该基因的cDNA长度一致，证明HSP70基因在ORF内不存在内含子。

序列同源性比较结果显示褶纹冠蚌HSP70与紫贻贝氨基酸序列同源性达到79．47%，与美洲牡蛎氨基酸序列同源性达到77%，与人HSP70同源性达到69．15%，与果蝇氨基酸序列同源性达到73．18%。

N－J系统树表明所列物种聚成四支，其中人、牛、鱼、非洲爪蟾等脊椎动物聚成
一支，而软体动物聚成不同的两支，其中一支代表物种主要有合浦珠母贝、企鹅珍珠贝、海湾扇贝、栉孔扇贝和虾夷扇贝；另一支代表物种有紫贻贝、美洲牡蛎、太平洋牡蛎和香港巨牡蛎，褶纹冠蚌HSP70也聚在这支。

最后一支是昆虫纲动物组成（图1）。

对照组（20℃）中蚌的5种组织HSP70均有表达，其中在鳃组织中的表达量较高，其次是肌肉，血液组织内的表达量最小（图2a）。

而热休克处理组（35℃）中蚌的5种组织HSP70表达量明显的增加，其中在血细胞和鳃内的表达量最大，其次是肝胰腺和外套膜，而肌肉内的表达量相对较少（图2b）。

统计分析热休克处理后，蚌5种组织的HSP70相对表达量均显著高于对照组的表达量，其中血细胞和鳃组织内的表达量变化最显著，外套膜和肝胰腺内的表达量增加也较明显，而肌肉内的表达量变化不明显（图2c）。

注射PBS刺激蚌后，对照组蚌各组织内均有HSP70的表达（图3a）；而经细菌
刺激后，蚌5种组织中HSP70都有表达且表达量出现明显的增加，其中在肌肉内的表达量最大，其次是鳃组织，外套膜的表达量最少（图3b，c）。

在注射嗜水气单胞菌6 h后，HSP70的表达量仅血液和外套膜组织增加明显，而其它组织增加
不明显，12 h后5种组织中HSP70的表达都达到峰值，其中血液、鳃和肌肉内
的表达量增加最为显著，之后表达量趋于稳定，随后逐渐下降，48 h表达水平恢
复到正常状态（图4）。

HSP70大约由650个氨基酸组成，是一组进化上高度保守的应激蛋白，无论是原核生物还是真核生物的HSP70的氨基酸序列均有很高的同源性，亲缘关系近的物种 HSP70同源性更高［3，10］。

通常HSP70家族含有3个保守的签名序列（IDLGTTYS，VFDLGGGTF DVSIL，VVLVGGSTRIPKVQK）［5，10］，其所有成员均具有3个重要的功能区域，N端高度保守的44 k Da氨基端腺苷酸结合区
域（Nucleotide－Binding Domain，NBD）或 ATPase功能域，该区域能够结
合和水解ATP，为绑定和释放其它底物提供能量；18 k Da底物结合区域（Sub－strate Binding Domain，SBD），该区域由2个β－折叠组成一个口袋结构，在此结构中底物相互发生作用；10 k Da的 C 末端区域（Carboxy－Terminal Domain，CTD），该区域富含α－螺旋结构并且形成一个盖子样的结构覆盖在底
物结合区域的上面［11－12］。

HSP70基因没有内含子存在，这一特异性保证了它们一旦启动转录就可产生出成熟的mRNA以适应HSP70大量快速表达的需要，防止应激原对其m RNA前体的影响。

从而保证了机体对HSP70的需要［13］。

本文克隆的褶纹冠蚌HSP编码638个氨基酸，理论分子量为70．3 k Da的蛋白，含有HSP70家族的3个标签序列，ATP酶结构域，底物肽结合结构域，以及C
端结构域，而且基因组扩增也证实基因内不含有内含子，说明它属于HSP70家族。

多数物种的HSP70蛋白C末端存在一个重要的GGMP四肽重复序列和EEVD序列，它们能够与α螺旋亚区在C末端形成一个结构实体，该结构实体可能参与调
节HSP70与分子伴侣的结合［14］。

以前的研究认为组成型的HSP70都具有四
肽序列［14－15］，而诱导型的没有该序列［6］。

后来发现食用牡蛎（Concha ostreae）的组成型和诱导型HSP70都具有此序列，因此，该四肽序列的有无，
不完全与HSP70的类型有关［5，16］。

褶纹冠蚌 HSP70不具有该序列，与合
浦珠母贝和美洲牡蛎的HSP70是一致的［4－8］；另外，还发现褶纹冠蚌
HSP70蛋白的C末端存在的是EEMD序列而不是常见的EEVD，这与美洲牡蛎（CAB89802），九孔鲍（ACO36048）和香港巨牡蛎（ACH95805）的序列结
构是一致的；这可能是个别氨基酸的突变所引起的，对蛋白的功能有无影响，有待于进一步实验。

热休克蛋白是一种应激蛋白，可以作为一种“危险信号”传递给免疫细胞，从而触发免疫应激反应，从而起到对细胞的保护作用［17］。

太平洋长牡蛎在37℃高温下预处理2 h，HSP70在鳃部大量积累，再将牡蛎置于44℃致死温度下，其生长期较对照组延长了2周［18］。

皱纹盘鲍（Haliotis discus）经热处理后肌肉内
的HSP70 mRNA表达急剧地增加，24 h后达到最大表达量，随后表达量逐渐下降，直到96 h后表达量达到正常水平；鳃组织经热休克处理后，12 h达到最大表达量［19］。

银鲷鱼（Sparus sarba）在急性热休克（＋7℃）处理后，组成型
HSC70的表达量增加1．7倍，而诱导型HSP70的表达量增加6．7倍［20］。

高温处理合浦珠母贝后的贝类各组织HSP70的表达量明显增加，表达量由大到小依次为鳃、消化腺、外套膜、肌肉、性腺［8］。

本实验中，热休克处理褶纹冠蚌后，蚌各组织中的HSP70 m RNA表达量有明显的提高，鳃组织的表达量增加最大，其次血淋巴，增量最小的肌肉。

细菌的入侵，使机体出现了免疫应激反应，大量合成HSP70等应激蛋白，起到保护机体以及杀灭入侵细菌的重要作用。

皱纹盘鲍经鳗弧菌（Vibrio anguillarum）刺激后，肌肉和鳃组织内的HSP70 m RNA的表达量急剧增加［19］。

海湾扇贝
注射了鳗弧菌后，血细胞中的HSP70 m RNA的表达量在注射后8 h达到最大量，并且一直维持到16 h［7］。

紫贻贝在注射鳗弧菌后12～48 h内，对HSP70基
因的表达起到正调节的作用，直到72 h后，HSP70基因的表达才恢复到正常水平［21］。

经嗜水气单胞菌的刺激后，褶纹冠蚌各组织中HSP70 m RNA的表达都
有较明显的正调节作用，其中增加最显著的是肌肉，其次是鳃组织。

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