多肽植物激素系统素及相似多肽的质谱裂解机理和反相色谱保留规律研究

多肽植物激素系统素及相似多肽的质谱裂解机理和反相色
谱保留规律研究
杜甫佑1,2白玉1白玉1刘虎威*1
【摘要】采用液相色谱-四级杆飞行时间质谱(LC-QTOF-MS)联用技术,研究了系统素及其相似多肽的质谱裂解机理和色谱保留规律,探讨了它们的碰撞诱导解离规律。

结果表明,系统素准分子离子一般带有2～5个电荷;在低碰撞能条件下,多肽母离子发生碰撞诱导解离,产生b型和y型碎片离子;烟草系统素I最强母离子[M+3H]3+的最优碰撞能为22 V;番茄系统素、土豆系统素Ⅰ、土豆系统素Ⅱ、辣椒系统素和龙葵系统素的最强母离子均为[M+4H]4+,最优碰撞能均为18 V;在最优碰撞能作用下,系统素的碎片离子信息丰富,特征碎片离子峰的强度最大,适合对系统素的分析;样品中三氟乙酸的含量对系统素及相似多肽在反相色谱柱上的保留影响明显。

【期刊名称】分析化学
【年(卷),期】2011(039)008
【总页数】6
【关键词】系统素;植物多肽激素;液相色谱-四级杆飞行时间质谱;裂解机理;保留规律
【文献来源】https:///academic-journal-cn_chinese-journal-analytical-chemistry_thesis/0201230574532.html
1 引言
植物多肽激素与其它小分子激素一样,参与了植物的生长、发育等过程的调控,是一类非常重要的植物激素[1～5]。

已发现的植物多肽激素主要有系统素、植物
硫肽素和快速碱化因子等,其中番茄系统素是研究最早、最多的一类多肽激素[6]。

系统素作为系统性防御反应的信号分子,在土豆、辣椒、龙葵等其它茄科植物中也存在,它们具有相似的功能[4,7],但各系统素的氨基酸组成及序列有明显的差异(表1)。

另外,系统素在植物体内的含量甚微,快速、准确测定其含量仍面临很多挑战[6,8,9]。

质谱在多肽定性与定量分析及结构鉴定方面有显著优势,利用多肽在不同质谱条件下的裂解规律及碎片信息,可发现和确认新的植物多肽激素[10]。

此外,多肽在色谱柱上的保留具有一定的规律和可预测性,可采用LC对目标多肽进行定性与定量分析[11,12]。

本研究采用液相色谱-电喷雾离子化-四级杆飞行时间质谱(LC-ESI/QTOF-MS)联用技术,系统研究了系统素及相似多肽的质谱裂解机理和色谱保留规律,为准确研究系统素及发现新的植物多肽激素提供了新的分析方法。

2 实验部分
2.1 仪器与试剂
AcquityTM超高效液相色谱仪、Xevo QTOFMS质谱仪和MassLynx V4.1数据处理系统(美国Waters公司)。

番茄系统素、土豆系统素Ⅰ、土豆系统素Ⅱ、辣椒系统素、龙葵系统素、烟草系统素Ⅰ、系统素-14、系统素-22和系统素-A la(4),共9种多肽,均由北京中科亚光生物科技有限公司合成,其英文名称、英文缩写、氨基酸组成及序列见表1;甲醇、乙腈和甲酸(美国Dikma公司);三氟乙酸(美国Acros公司),其它试剂均为分析纯。

系统素标准储备液(1.0 g/L)采用10%(V/V)乙腈酸性水溶液(含0.1%甲酸)配制;工作溶液用含0.1%甲酸和0.1%三氟乙酸的10%乙腈酸性水溶液稀释。

所有样品均保存在5℃冰箱中。

2.2 分析条件
2.2.1 色谱条件ZORBAX SB-C18色谱柱(150 mm×2.1 mm,
3.5μm,美国Agilent公司);流动相A:含0.1%甲酸的90%乙腈溶液;流动相B:含0.1%甲酸的2%乙腈溶液;梯度洗脱:0～10 m in,5%～15%A;10～18 m in 15%A。

流速0.2 m L/m in,柱温为室温,进样量10μL。

2.2.2 QTOF-MS主要参数正离子扫描(ESI+,m/z 100～1200),毛细管电压
3.0 kV,样品锥孔电压28 V,取样锥孔电压
4.0 V;离子源温度90℃,脱溶剂气温度250℃;样品载气流量40 L/h,脱溶剂气体流量600 L/h。

在MS/MS实验时,除了需要设定碰撞电压外,其它实验参数的设置与MS实验一致。

3 结果与讨论
3.1 系统素及相似多肽的MS谱图分析
系统素及相似多肽的MS实验结果见图1和表1。

9种多肽均有2～5种多电荷准分子离子峰,其中Tom Sys,PotSys,PotSysⅡ,PepSys和NishSys的最强准分子离子分别为m/z 503.5132,499.0027, 491.9938,494.4983和506.2607([M+4H]4+);TobSysⅠ的最强准分子离子峰为m/z 623.6324 ([M+3H]3+),系统素类似多肽Sys-A la(4),Sys-14和Sys-22的最强准分子离子峰分别为m/z 477.4877 ([M+4H]4+),384.4659([M+4H]4+)和496.8538([M+5H]5+)。

3.2 系统素及相似多肽的MS/MS谱图分析
从图2可知,在碰撞能为20 V时,母离子m/z 403.068[M+5H]5+被完全裂解,其特征碎片的离子峰少且强度低,大部分为小分子碎片离子;母离子m/z 503.520([M+4H]4+)的特征碎片离子峰多且强度较大;而母离子m/z
671.025([M+3H]3)被裂解的很少,特征碎片离子峰少且强度小。

以上结果表明,在相同碰撞能作用下,不同电荷的准分子离子,其碰撞诱导解离(Collision-induced dissociation,CID)谱图差异较大;多肽带的电荷越多,越易被裂解。

当碰撞能在10～25 V时,TomSys母离子[M+4H]4+的特征碎片离子峰m/z 608.3108,614.3218和816.4037的强度随碰撞能的增加而改变(图3);当碰撞能为18 V时,母离子绝大部分被裂解,产生较多的特征碎片离子峰,且特征碎片离子峰m/z 608.3108最强,最有利于对TomSys进行定性与定量分析。

在碰撞能为10～28 V时,PotSys I,PotSysⅡ,PepSys,NishSys,TobSysⅠ,Sys-A la(4),Sys-22和Sys-14的质谱裂解规律与Tom Sys类似,即对应的特征碎片离子的数量、分布及强度的变化与Tom Sys的裂解相似,其对应的最优碰撞能分别为18,18,18,18,22,18,15和15 V,可分别采用特征碎片离子m/z 392.0795,383.5321,451.9866(或602.3148),402.5620,512.2941,373.6072,578.2902和341.2214进行定量分析(图4)。

从图4可知,系统素及相似多肽的最强准分子离子在最优碰撞能条件下,主要产生b型和y型碎片离子。

Tom Sys母离子[M+4H]4+产生b12,y16-NH3,y16,y15,y13和y7等特征碎片离子峰(图4A);碎片离子峰相对强度表明,Tom Sys氨基酸序列中y16处最易被裂解,其次是y7处,说明在低碰撞能作用下谷氨酰胺氨基端链易被裂解,其次是脯氨酸氨基端。

对于PotSys I,PotSysⅡ和NishSys,b11和y7的碎片离子峰最强,表明这3种系统素易于从脯氨酸氨基端裂解(图略);PepSys最强母离子裂解时,y16和y11的碎片离子峰最强,组氨酸氨基端易被裂解(图4B);对于TobSysⅠ,最强碎片离子峰是b5,其次是y5和b9,多肽中亮氨酸羧基端最易被裂解,其次是脯氨酸或羟基脯氨酸的氨基
端;Sys-A la(4)和Sys-22两种多肽的谷氨酰胺氨基端易被裂解,而Sys-14易于从脯氨酸氨基端裂解(图4C)。

以上结果表明,系统素及相似多肽最强母离子通常从多肽中谷氨酰胺和脯氨酸的氨基端裂解。

3.3 液相色谱分析
流动相中的三氟乙酸(TFA)可改善反相色谱柱对多肽的分离效果,但残留的TFA 可能会抑制质谱的离子化效率。

本实验仅用甲酸调节流动相的pH值,当采用含0.1%甲酸的10%乙腈酸性水溶液配制的系统素进行分析时,各系统素的保留时间均为2.09 m in,不能有效分离;如改变流动相中甲酸的浓度,对多肽的离子化效率有一定的影响,但对其在色谱柱上的保留时间几乎无影响;在样品溶剂中添加0.05%～0.1%(V/V)TFA,显著改善了系统素在色谱柱上的保留,TFA的含量为0.1%时,5种系统素被有效分离(图5),其原因在于样品溶液中TFA所具有的离子对效应改变了系统素与色谱柱表面硅羟基之间的相互作用,从而改变了系统素在色谱柱上的保留时间。

4 结论
采用LC-ESI-QTOF-MS联用技术可准确分析系统素及相似多肽的准分子离子峰及其分布规律,研究其准分子离子的裂解规律;在电喷雾离子化过程中,系统素及相似多肽均带有2～5个电荷;最强准分子离子的CID谱图表明,多肽中谷氨酰胺和脯氨酸氨基端最易被裂解,主要产生b型和y型碎片离子;可通过最强准分子离子的特征碎片离子对系统素进行准确的定性与定量分析。

三氟乙酸的离子对效应对系统素在反相色谱柱上的保留有明显影响,样品溶剂中含有0.1%TFA时,即可实现系统素在色谱柱上的有效分离。

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2010-11-17收稿;2011-03-17接受
本文系国家自然科学基金(Nos.90717002,20905005,20805001)和中国博士后科学基金(No.201003008)资助项目
*E-mail:hw liu@
【文献来源】https:///academic-journal-cn_chinese-journal-analytical-chemistry_thesis/0201230574532.html。