α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测

氨基相连处
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酶的固定化方法
酶
物理吸附法
交联法
包埋法
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固定化酶的性质
• 稳定性增加： 对热、蛋白酶及各种试剂的稳定性。
• pH活性曲线和最适pH的变化：
可能向酸性或碱性方向移动。需实验确定 • 底物的专一性变化：
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用脲酶固定化酶测定血液或尿中的尿素含量。
在医药上的应用：
将苯丙氨酸羟化酶及其辅酶制成不溶酶，注射到患者 体内，可有效治疗苯丙酮尿症。
缺少乳糖酶，不能水解牛乳中的乳糖，引起腹痛腹 泻，可用乳糖酶固相酶在体内或体外水解乳糖。
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讨论
1、试验中为什么要待固定化酶柱中流出5ml液体后再接 收流出液用于鉴定？
三、α-淀粉酶的固定化及 淀粉水解作用检测的实验
1、实验目的：
（1）制备固定化α-淀枯粉草酶杆；菌的α-淀粉酶：
（2）进行淀粉水解的测最适定p。H5.5～7.5
最适温度55～75℃ 2、实验原理：
用吸附法将α-淀粉酶固定在石英砂上。一定浓度的
淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精。用淀
粉指示剂溶液（KI－I2）测试，流出物呈红色，表明水解
寻找耐高温的淀粉酶的目的是在高温下使淀粉水解快， 而且酶不会因高温而在短时间内变Байду номын сангаас。在发酵生产中使 用的往往是植物淀粉，如青霉素发酵、乙醇发酵等都要 水解淀粉，所以耐高温淀粉酶用途广泛。
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2.影响酶在载体（吸附剂）上吸附程度
的因素:
1、pH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。 2、离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。
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（三）共价偶联法
是目前研究中最为活跃的方法。它的原理是 酶蛋白的一些基团，在温和的条件下与载体 共价结合，形成共价键，从而被固定化。
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（四）、交联法
是酶分子和多功能试剂之间形成共价键及酶蛋 白的氨基相连得到三维的交联网状结构
答案：因为固定化酶柱中的酶与流经柱子的淀粉反 应需要一定的时间，刚开始流出的液体中由于反 应时间过短，糊精未生成或生成的量太少，所以 不利于后面的颜色鉴定。
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2、如何证明洗涤固定化淀粉酶柱的流出液中没有淀粉酶？
答案：可在试管中加入1ml可溶性淀粉溶液，再加入 几滴淀粉酶柱的流出液，混合后用手握住试管增加
固定化酶的优点
• （1）使酶固定化后有一定的机械强度，催化反 应的过程可管道化、连续化和自动化；
• （2）酶不溶解在催化反应的溶液中，产物更易 纯化；
• （3）固定化酶可反复使用，更经济，更利于工 厂化生产；
• （4）固定化酶提高了酶的稳定性，可较长时间 贮存和使用；
固定化酶的不足之处
不能催化一系列反应
温度，几分钟后加入1～２滴KI-I2指示剂，如仍显蓝 色，即流出液中没有淀粉酶了。
用固定在石英砂的淀粉酶柱再作用于淀粉溶液， 使其自柱中流出，作用的结果才能表明是淀粉酶的 固相酶作用的结果。
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3、耐高温的淀粉酶有哪些可能的用途？
答案：在实际生产中，总希望反应的时间越短越好， 这就要提高反应温度。通常生产上淀粉酶是一次 性使用的，加温虽在短时间内会使酶变性失活， 但只要使淀粉在短时间内水解即可。
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二、酶的固定化
• 方法：
吸附法 包埋法 共价偶联法 交联法
•目的：
水溶性酶 物理、化学方法 不溶于水且有酶活性 • 机理：
将固定化酶装柱，当底物经过该柱时， 在酶的作用下转变为产物。
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(一)、吸附法
吸附法是将酶与吸附剂接触，再经洗涤除 去未吸附的酶便能制得固定化酶。是最简单的 固定化技术，在经济上也最具有吸引力。
1、根据吸附剂的特点分为两种：
物理吸附法
通过氢键、疏水键等作用力将
酶吸附于固体吸附剂的方法.
如有机硅胶、活性炭和石英 砂等
离子结合法
利用酶的两性基团和离子交 换剂的相互作用（离子键）。 吸附量大
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（二）、包埋法
将酶包埋在多孔的载体中，包埋成格子型或 包埋成微胶囊型
6、实验结果：
• 淀粉溶液+指示剂：
呈蓝色
• 亲和层析洗脱液+指 示剂： 呈红色
• 贮于冰箱几天后重复 实验：
呈红色
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固定化酶的用途
在工业上的应用：
柚苷酶固定化酶用于果汁脱苦； 木瓜蛋白酶固定化酶用于啤酒澄清；
葡萄糖异构酶固定化酶用于制造果糖，提高甜度。
在化学分析和临床诊断上的应用：
3. 蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度 增加，吸附量也增加，直至饱和。
4. 温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。 5. 吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比
小分子慢得多。 6. 载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越 强。
多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大
小。
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产物糊精生成。
α-淀粉酶
淀粉
糊精β-淀粉酶
麦芽糖
糖化淀粉酶 葡萄糖
遇碘显蓝色 遇碘显红色 遇碘不显色
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3、设备及用品：
5ml塑料注射器、50ml烧杯、滴管、自行车用气门 芯及夹子、注射器架、试管或微量离心管3支
4、实验材料及其制备
（1） α-淀粉酶的固定化：
5mgα-淀粉酶+4ml蒸馏水+5g石英砂，搅拌，30min
→装入层析柱→10倍体积的蒸馏水洗涤此注射器，流速为
1ml/min（约20滴） （2）可溶性淀粉溶液：
50mg可溶性淀粉溶于100ml热水中，搅拌均匀。 （3）5mmol/L KI-I2溶液
0.127g碘+0.83g碘化钾+蒸馏水100ml,完全溶解 后装入滴瓶中。
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提高了生产成本，也可能影响产品质量。
怎样解决这些问题呢？
——固定化酶技术
第二页，编辑于星期五：十点 五十八分。
一、酶与固定化酶
• 酶 活细胞产生的具有生物催化作用的 生物大分子。
• 固定化酶 将水溶性的酶用物理或化学的方 (固相酶) 法固定在某种介质上，使之成为
不溶于水而又有酶活性的制剂。
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5、实验步骤：
将注射器固定在注射器架上
用滴管滴加淀粉溶液，流速0.3ml/min，（尽量慢）
流出5ml后接收0.5ml（约10滴）流出液
加入1~2滴KI-I2溶液，观察颜色
用水稀释1倍后再观察颜色（与对照组比较）
实验后，10倍柱体积蒸馏水洗涤此柱，放置在4℃冰箱中
几天后重复实验，观察结果
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实验6 α-淀粉酶的固定化及 淀粉水解作用的检测
第一页，编辑于星期五：十点 五十八分。
酶作为生物催化剂,具有专一性和高效性.现在被 大量使用在食品、化工、医药等领域。然而，在 应用酶的过程中，人们也发现了一些实际问题：
（1）不稳定：酶通常对强酸、强碱、高温和 有机溶剂等条件非常敏感，容易失活； （2）不利于工业化使用：溶液中的酶很难回收，