Western Blotting实验

WB实验
蛋白质提取：
1、取适量新鲜大鼠肌肉组织100mg，加1ml预冷的RIPA裂解液（中），在冰上于玻璃研磨器中充分研磨，放置5min，4℃、12000r离心15min，取上清即为蛋白提取液。

蛋白定量后4份的蛋白提取液与1份的5X蛋白上样缓冲液混合。

-80℃冰箱保存。

2、蛋白上样前沸水煮5min， 5ul、10 ul、15 ul交替上样。

制备SDS-PAGE胶:
10%分离胶溶液12ml（两块胶）
1 双蒸水 4.86m
l
2 1.5MTris-HCl缓冲液，pH8.8，0.4%SDS 3ml
3 30%丙烯酰胺溶液4ml
4 10%AP 100ul
5 TEMED 8ul
灌胶至制胶架绿色小门上1mm处，然后轻柔地加入双蒸水，隔绝空气，室温静置30分钟待凝
5%浓缩胶5ml（两块胶）
1 双蒸水 2.87m
l
2 0.5MTris-HCl缓冲液，pH6.8，0.4%SDS 1.25m
l
3 30%丙烯酰胺溶液0.83m
l
4 10%AP 50ul
5 TEMED 5ul
待分离胶完全凝聚后（能看出折线），倒掉双蒸水，用滤纸吸干。

灌满浓缩胶，轻柔的从一侧开始放入梳子，30分钟待凝。

注意！！！烧杯中剩余的未凝的配胶溶液不要随意丢弃，要装在回收胶的50ml离心管里，待完全凝集没有毒性后丢弃。

电泳：将凝好的胶板装入电泳仪（短板向内，玻璃板下面的气泡要排出），内外槽均加入电泳缓冲液，内槽要加满。

左边第一孔加Marker：10μl /孔，其它孔上样品，每孔加5-15μl。

电压80V，待跑出浓缩胶、进入分离胶后，调电压至120V或100V--至目标条带到达中间位置，如果电泳太慢，体系有问题！
5×电泳缓冲液配方：槽内的电泳液可以回收，但是外槽的不要回收
1 Tris碱15.1g
2 甘氨酸94g
3 SDS/10%SD5g/50ml
S
4 HCl 调pH8.3
5 双蒸水1000ml补充至
考马斯亮蓝染色：
染色时间：1小时
脱色时间：脱色30分钟后换脱色液，（染色液和脱色液回收）脱色至结果满意为止，然后换成清水。

拍照。

电转：
将PVDF膜和滤纸裁成同凝胶尺寸一致大小，转膜所需的PVDF膜，需预先在甲醇中浸泡，然后转入转移缓冲液中浸泡；滤纸、海绵、凝胶也在转移缓冲液中浸泡；
100V—75min，内部放冰带，外部埋冰，PVDF膜用前要在甲醇中浸泡
三明治顺序：黑——海绵+滤纸5块+胶+膜+滤纸5块+海绵——白
注意：排去滤纸、胶和膜间的气泡，
10×转膜液配方（配好后4度预冷）
1 Tris碱24.2g
2 甘氨酸144.2g
3 双蒸水补充至1000ml
1L的电转液：100ml 10×电转液+200ml甲醇+700ml双蒸水,使用时预先配好，4℃冷藏
丽春红染膜：（染液回收）
用铅笔在膜正面做标记；
转膜结束后，用镊子取下膜，正面朝上置于事先准备的丽春红平皿中染色1-5分钟；蛋白条带显色后，用蒸馏水冲洗数次至条带对比清晰，拍照，然后用清水洗净
封闭：5%脱脂奶粉（PBST配置）
加入封闭液10ml，室温摇床封闭1.5小时。

PBS缓冲液配方：pH7.4
1L 5L
1 NaCl 8g 40g
2 KCl 0.2g 1g
3 Na
2HPO
4
·12H
2
O 3.489g 17.445g
4 KH
2PO
4
0.2g 1g
TBST配方：
TBST=16g NaCl+2ml吐温+40ml1M Tris-HCl pH7.4+双蒸水补充至2L
Tween-20：0.1%
一抗孵育：
1:1000（5%脱脂牛奶配置），4℃过夜，第二天下午，PBST洗3次，每次10min，然后二抗
二抗孵育：
1:5000（PBS配置），摇床上室温孵育1h，PBST洗3次，每次10min，然后显色
显色：
A、B、C三瓶显色剂各一滴(约50ul)加入850ul蒸馏水中混匀，在保鲜膜上避光显色，显出清晰条带为止。

拍照。

课前准备：
1、低温试剂：4℃保存的：一抗，10%AP，TEMED，30%丙烯酰胺溶液，分离/浓
缩胶缓冲液，5X蛋白上样缓冲液，RIPA裂解液，电转液（预冷）
-20℃保存的：二抗，DAB显色剂
2、室温试剂：脱脂奶粉，丽春红，Tween-20，电泳液，甲醇
3、仪器、耗材：电泳槽3个，电转槽2个，制胶架3套，玻璃板6套（1.0mm 厚板，薄板各6块），小盒6个（3块盛胶，3块盛膜），转膜夹子3块，PVDF膜，培养皿，滤纸，小镊子，试管，铅笔，剪刀，尺子。