HIV_1 p24单链抗体的构建及其噬菌体文库筛选

文章编号:1007-4287(2006)04-0385-04
HIV21p24单链抗体的构建及其噬菌体文库筛选
王　波1,王贤俊2,温志国3
(1.大连市第六人民医院检验科,辽宁大连116001;
21温州维日康生物技术研发中心;3.内蒙古包头医学院附属三院)
摘要:目的　通过噬菌体展示技术构建HIV21p24单链抗体库,从中筛选出高亲和力的抗体基因,为进一步单链抗体表达打下基础。

方法　从HIV患者的血清中提取mRNA,RTP2CR扩增出HIV21p24基因,扩增的产物用ClaⅠ和BstxⅠ双酶切消化后,连接到同样双酶切的p IRES1表达质粒,把构建的重组p IRES1-p24质粒免疫Balb/c小鼠。

1个月后,取鼠脾细胞mRNA构建出单链抗体(ScFv)cDNA文库。

该文库以噬菌粒pCAN TAB5E cDNA为载体,转化大肠杆菌TG1,最后用p24蛋白对表达的重组噬菌体单链抗体文库进行筛选。

结果　经过4轮吸附2洗脱2富集筛选,洗脱噬菌体滴度大于1010pfu/ml,EL ISA及其测序表明获取了表达抗HIV1p24单链抗体的基因。

结论　单链抗体和噬菌体展示技术成功的应用简化了获取特异性的单链抗体基因程序。

关键词:人类免疫缺陷病毒;p24;单链抗体
中图分类号:R392111文献标识码:A
Construction and selection from a peptide phage display library of the single2chain Anti2HIV21P24　W A N G Bo,W A N G Xian2jun,W EN Zhi-guo.(The S ixth People’s Hospital of Dalian Clinical L aboratory,Dalian116001,China) Abstract:Objective　cDNA library of anti2HIV1p24Single Chain Fragment of Variable Region(ScFv)was construct by phage display technology in order to express the ScFv in the future.Methods　The template of mRNA was extracted from serum of patients,subsequently the gene of HIV21p24was amplied by RT2PCR.The amplied product was digested by ClaⅠand BstxⅠ,then the digested product was transfered into p IRES1express vector digested by the same two enzymes.The re2 combinant plasmid immuned Balb/c mice,after one month,ScFv cDNA librar y was constructed from the s pleen cell mRNA of mice.ScFv cDNA library of pCAN TAB5E plasmid carrier was transformed into E.coli TG1that of secretin g specific anti2 HIV1p24ScFv was obtained by p24protein affinity selection.R esults　After four times absorb2wash2enrich selection,2×1010phage form unit(pfu)/ml was got.Both EL ISA and sequenced measures proved to succeed in secreting specific anti2 HIV1p24ScFv gene.Conclusion　ScFv and phage display technologies successly applied that simplied the acquiring proce2 dure of specific ScFv gene.
K ey w ords:HIV;p24;ScFv
(Chin J L ab Diagn,2006,10:385)
目前对HIV21感染的筛查,以检测血中的抗体为主,但是HIV21病毒感染机体4～6周前抗体检测为阴性,此时患者体内病毒已存在。

这段在抗体产生之前的时间称为窗口期[1],窗口期的存在导致了部分HIV21携带者的漏检。

因此,为了提高HIV21携带者的检出率,在进行HIV抗体筛查后,再进行HIV21抗原的检测有助于提高HIV21感染的检出率,及其可作为艾滋病病程监测、预后判断和治疗效果评价的重要指标[2,3]。

HIV21p24抗原在HIV急性感染期和A IDS病程后期均可出现,而且结构稳定,不易产生变异。

因此,p24抗原是进行诊断和治疗的理想靶位,相应的制备特异性的抗p24单链抗体即可对p24抗原进行定量,从而做出相应的临床诊断。

所谓的单链抗体(single chain Fragment of variable region,ScFv)是一种基因工程抗体[4],即利用基因工程方法使抗体重链可变区(V H)和轻链可变区(VL)通过一段约5～25个氨基酸的连接肽,首尾拼接而形成的重组蛋白。

该抗体具有分子量小、易于大肠杆菌发酵生产和进行基因工程改进等优点,为大量表达目的抗体基因提供了条件,尤其是噬菌体文库即噬菌体抗体表达系统的建立,为在体外筛选高亲和力抗体提供了方便[5]。

2004年尹红章等报道制备出HIV21p24单克隆抗体[6],但考虑到天然HIV p24抗原获取的困难,及其人工表达或合成的的p24抗原作为免疫原容易失去天然的构象而导致获取的抗体亲和力低下,及其单抗方法制备量低、成本高等固有缺点。

本研究采用含p24基因片段的真核质粒免疫Balb/c小鼠,提取被免疫鼠的脾细胞mRNA并反转录成cDNA,利用重组噬菌体表达系统构建出一个组合的单链抗体cDNA文库,从中筛选抗p24的单链抗体,酶切鉴定及其测序表明成功的获得了抗p24的单链抗体基因,从而为进一步表达高亲和力的HIV21p24单链抗体及其艾滋病的基因治疗打下基础。

1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验动物
6～8周龄Balb/c小鼠,购自温州医学院动物房。

1.1.2　实验试剂及标本
用于扩增鼠抗体重轻链可变区cDNA的特异性PCR引物(Heavy primer1和2、Light primer mix2 ture、Linker primer、RS primer),噬菌体表达载体pCAN TAB5E,以及E coli TG1M13K07helper,T7测序试剂盒,cDNA合成试剂盒,Sephaglas核酸片段回收试剂盒,脾脏mRNA提取试剂盒等均购自Phamacia公司。

病毒mRNA提取试剂盒,来自Q I2 A GEN公司(Q IAamp Viral RNA Mini K it)本次共收集全血样本2份,均经EL ISA初筛试验阳性并经Westernblot法确认为HIV1阳性,血清由温州市第二人民医院检验科提供。

1.1.3　HIV RNA的抽提及其逆转录
采用ED TA抗凝的全血经3000r/min离心30 min分离出血浆,使用病毒RNA抽提试剂盒,操作按说明书步骤进行。

每个病人的血浆用量为200μl,按照所要求的比例逐步加入缓冲液、乙醇等,最后提取的RNA溶于50μl经DEPC处理的水中。

按以下条件组成逆转录反应体系:样品总RNA5μl、AMV逆转录酶20IU、随机引物100pmol、dN TP(每种dN TP各10mmol/L)2.0μl、5×逆转录缓冲液4μl、RNasin(20IU/μl)0.5μl、DEPC处理水补至20μl。

1.1.4　真核质粒的构建及免疫
设计分别带ClaⅠ和BstxⅠ酶切位点的引物, PCR获取目的基因,用ClaⅠ和BstxⅠ双酶切, p IRESneo质粒经过同样的双酶切后,琼脂糖凝胶电泳、切胶经UN IQ210柱式DNA胶回收试剂盒纯化,用T4连接酶16℃连接过夜。

然后,转化感受态E.coli DH5α细菌。

再将转化菌涂布于含30μg/ml 新霉素的LB平板上37℃培养过夜,挑取单菌落扩
大培养。

提取质粒,酶切电泳,PCR扩增鉴定。

动物免疫:用提取的真核质粒DNA疫苗以腿部肌肉注射,对10只Balb/c鼠每只注射100μg质粒,免疫间隔时间为10天,共4次,末次免疫后10天杀鼠取脾。

摘眼球取血清测抗HIV2p24抗体, EL ISA试剂盒中的包被抗原为p24抗原,二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠Ig G抗体。

在酶联免疫仪450nm测量各孔OD值。

1.1.5　PCR扩增V H和VL及其连接
摘取免疫鼠脾脏,按试剂盒操作方法提取mR2 NA,并按cDNA合成试剂盒方法反转录合成cD2 NA。

用鼠抗体重、轻链可变区特异性引物,用PCR 方法从反转录合成的cDNA,分别扩增出轻、重链可变区基因,电泳分析V H、VL和Linker引物的浓度,使其调整至大约等摩尔数,采用重叠延伸拼接法(gene splicing by overlap extension,SOE)重组为单链抗体基因,得到连接有Linker的ScFv基因(V H2 Linker2VL),以此为模板在RS primer MiX的作用下再进行两次扩增。

1.1.6　构建鼠脾细胞噬菌体抗体库
把单链抗体基因与pCAN TAB5E质粒都用Sfi I和Not I酶切、再纯化、连接,转化大肠杆菌TG1感受态细胞。

重组菌经噬菌体M13K07超感染后表达噬菌体抗体。

以p24为抗原包被免疫管,进行4轮免疫筛选,用EL ISA鉴定重组噬菌体抗体的免疫活性。

1.1.7　ScFv基因的克隆及测序
将上述纯化的PCR产物,在T4DNA连接酶的作用下,与pMD182T载体系统进行连接,转化至受体菌DH5α中,转化菌经IPTG/X2gal琼脂平板上的α互补进行蓝白菌落筛选,挑取白色菌落,提取质粒用Sif I和Not I进行酶切鉴定,提取并纯化含ScFv 的重组质粒用AB I377全自动荧光DNA序列分析仪进行测序。

2　结果
2.1　真核质粒及其免疫效果的鉴定
琼脂糖凝胶电泳见图1,PCR方法扩增出了一条约700bp的片段,与预计bla TEM2116基因大小一致,且经ClaⅠ和BstxⅠ双酶切后得到约700bp 和5200bp两条片断。

酶切图谱与预期结果完全一致,表明重组真核质粒构建正确(见图1)。

在酶联免疫仪450nm测量免疫前后小鼠血清OD值。

免疫前后抗p24EL ISA效价分别为小于1∶100和大于1∶3200。

图1　真核质粒pIRES12p24的鉴定
11Marker ;21p IRES1
-p24质粒双酶切;31重组质粒PCR 产物
2.2　PCR 扩增VH 和V L
扩增的产物V H 和VL ,经2%琼脂糖凝胶电泳
观察,结果显示V H 基因片段约为320bp 左右,VL 基因片段约为350bp 左右,与预期的V H ,VL 基因片段大小相符(图2)。

图2　VH 、V L 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图
11VL PCR 产物;21VH PCR 产物;31Marker
2.3　鼠脾细胞噬菌体抗体库的筛选
重组噬菌粒经M13K07超感染后,被包装产生
成熟的噬菌体,将p24-ScFv 表达于噬菌体的表面,以p24抗原重组噬菌体抗体进行经过4轮吸附2洗脱2富集筛选,洗脱噬菌体滴度大于1010cfu/ml 。

表1为各轮富集得到的噬菌体滴度及阳性克隆检出情况,由第1轮到第4轮阳性率不断升高。

表1　噬菌体p242ScFv 文库四轮富集结果
第1轮
第2轮
第3轮
第4轮
阳性克隆(个)
02818阴性克隆(个)9088
8272阳性率(%)
0%
2.2%
8.9%
20.0%
2.4　ScFv 基因的克隆及测序
扩增挑选的重组菌,提取重组质粒pMD18-p242ScFv ,经Sif I 和Not I 双酶切,后得到约750bp 和2600bp 左右的两条片断,把纯化的质粒送宝生物测序,经Blast 比对,证明为p24单链抗体(图3)。

图3　重组质粒pMD182ScFv 2p24酶切电泳图
11pMD182ScFv 2p24质粒双酶切;21ScFv 2p24PCR 产物;31Marker
序列结果如下:
ATG GGC CA G TGT GTG ATT CTG CA G CA G TCA GGG GCA G A G CTT GTG
AA G CCA GTG GCC TCA GTC AA G TTG TCC ACA GCT TCT GGC TTC AAC
ATT AAA G AC ACC TAT ATG CAC TGG GTG A GG CA G A GG CCT G AA CA G
ATA CTG G A G TGG ATT GG A A GG ATT G AT CCT GCG AAT GGT AAT ACT
G AC TAT G AC CCG AA G TTC CA G GGC AA G GCA CTA TAA CA G CA G ACA
CAT CCT CCA ACA CA G CCT ACC TGC A GC TCA GCA GCC TGC ATC TGG
G AC ATG GCC GTC TAT TAC TGT GGT A GG TAC G AC TAT GCT ATG G AC
TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC TTC GTC TCC TCA GGT GG A
GGC GGT TCA GGC GG A GGT GGC TCT GGC GGT GGC GG A TCG G AC ATC
G A G CTC ACT CA G ACC TCT CCA GG A G A G CGC A GG G AT TTG CCA GGG
G AA ACG CCT GGT ATC TTT ATA GTC CTG TCG GGT TTC GCC ACC TCT
G AC TTG A GC GTC G AT TTT TGT G AT GCT CGT CA G GGG GGC GG A GCC
TAT GG A AAA ACG CCA GCA ACG CGG CTT TAC GGT TGG CCT TCG CTG
GGT GGC CTT TTG CTC ACA TGT TCT TTC TTT CGT TAT CCC CTG ATT
CTG TGG ATA ACC GTA TTA CCG CCT TTG A GT G A G CTG ATT CCG CTC
GCC GCA GCC G AA CG A CCG CGG A G A GCG GCC GCA AAA G AA GCG CGG
ATC GCG
3　讨论
本研究从被动免疫小鼠肌肉开始,在鼠脾脏细胞中提取mRNA ,再把噬菌体表面呈现技术应用在单链抗体的筛选,从而绕过了繁琐、冗长的杂交瘤技术。

噬菌体表面呈现技术通过PCR 将全套抗体H 链和L 链V 区基因克隆出来,以噬菌体pCAN TAB5E 为载体,把单链抗体基因与噬菌体外壳蛋白g3p 基因融合,将重组质粒转化大肠杆菌TG1,在辅助噬菌体M13K07的作用下,单链抗体和g3p 以融合蛋白的形式表达于噬菌体的表面,形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的膜表面,使噬菌体表面表达异源性分子,经筛选后获得特异性抗体基因。

噬菌体表面形成的融合蛋白不影响和干扰噬菌体的生活周期,同时又保持外源蛋白的天然构象不变,这一技术的主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在同一病毒颗粒内。

单链抗体的表达是通过所构建的表达载体转化宿主细胞来实现的。

目前单链抗体大多在E.coli 中表达。

大肠杆菌生长快速,易于操作,可在短时间内大规模地生产抗体蛋白,获取的单链抗体相对便宜。

单链抗体在大肠杆菌中的表达形式主要有三种:①包涵体表达。

这种方法蛋白表达量高,但产生的蛋白常常没有活性,需经体外的复性、纯化,才可能获得有活性的单链抗体;③融合表达。

蛋白可以利用
亲和层析,纯化较方便,但因为涉及切割融合蛋白需肠激酶、凝血酶等,所需成本较高;③分泌表达。

分泌表达是近来常用的表达方式。

在信号肽的引导下,单链抗体被分泌至大肠杆菌外周质或培养液中,分泌的过程中信号肽被自然切割。

因此,成本较为低廉,活性及其空间结构也保持的较好。

尽管单链抗体单链抗体技术有很多优点,但广泛应用于临床治疗之前,还有一些问题需要解决,例如:如何发展一些基因转移系统,使它们能够将单链抗体基因传递到足够数量的正确细胞类型中;如何使单链抗体基因在体内持久、稳定、高效地表达;如何使单链抗体蛋白无毒及其无免疫原性等[7]。

我们绕开临床治疗领域,把单链抗体应用于临床检验诊断领域,单链抗体种种问题就不复存在了,相反由于单链抗体能利用基因工程进行低成本、大批量的生产,其作为一种体外诊断试剂原料,具有广阔的市场前景,同时本研究开发的p24单链抗体基因也为HIV 的基因治疗打下一定基础。

参考文献:
[1]Lowdell MW ,Bainbridge DR.External quality assurance for CD34cell enumeration results of a preliminary national trial[J ].Bone Mar 2row Transplantation ,1996,17(5):849.
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[3]Thies K ,Anders C ,Bald us M ,et al.Detection of primary HIV infec 2tion by a second -generation HIV (p24)antigen test [J ].Infusions 2ther Transfusionmed ,1994,21(5):333.
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序列测定[J ].上海免疫学杂志,1999,19(1):81
[6]尹红章,李秀华,孟淑芳,等.HIV -1p24抗原检测的应用研究[J ].中国免疫学杂志,2000,16(3):1511
[7]胡宝成,俞炜源.单链抗体在基因治疗方面的应用[J ].国外医学・
免疫学分册,1999,22(4):1931
(收稿日期:2005-04-01)。