层析技术及原理

思考题 1. 血清r-球蛋白分离与纯度鉴定的原理?

层析可分哪几类？


3．简述离子交换层析和凝胶层析的原理? 4．主要有哪几个操作步骤?
图3-2 Rs计算示意图
图3-3 垂直线法计算Rs示意图
若Rs=1，则组分定会分离；Rs<1，则组分部分分离；Rs=0，组分不能分离或分离极差。
四.分配系数

在层析分离过程中，物质既进入固定相，又进入流 动相，此过程称分配过程。无论哪一种层析法，在一定条 件下，物质在固定相和流动相达到平衡时，它在两相中平 均浓度的比值称分配系数(K)。 分配系数是由溶质的性质(分子大小、电荷、分子量等) 所决定的。不同的层析机制，其K值涵义不同。吸附层析 中，K值表示吸附平衡常数；分配层析中，表示分配系数； 离子交换层析中，表示交换常数；亲和层析中，表示亲和 常数。K值大表示其溶质在固定相中浓度大，在洗脱过程 中，溶质出现较晚。K值小表示其溶质在流动相中浓度大， 故在洗脱液中出现较早。 若两组分在同一条件下具有相似的K值，则表明两组 分层析峰重叠大，分离效果差。为达到分离目的，需重新 选择实验条件，包括层析方式和流动相的改变。
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实际计算理论塔板数时，只要在层析图谱 上测出某组分的保留值和在一定纸速下相应的 峰宽，就可计算出在某一实验条件下的理论塔 板数的近似值，以衡量柱效。若要得到真正的 塔板数时，必需扣除未被固定相所占有的空间 死体积(如柱的接口、连接柱接口的管路体积) 和流动相为充满死体积时所需的时间，此时得 到的塔板数称为有效塔板数(neff)。故上述公 式可转化为：
层析中的常用术语
一、保留值(Retention Value)
保留值表示样品中各组分 在层析柱中停留时间的长短或 组分流出时所需流动相体积的 多少。它用来描述层析峰在层 析图上的位置(图3-1)
图3-1 A、B两组分的保留值 A保留值tR1’=tR1-tm B保留值tR2’=tR2-tm
二、层析峰区域宽度(Peak Width)





(三) 鉴定： 按醋酸纤维薄膜电泳的操作步骤，用小滴管吸取浓缩上清液8～10l点 样。并与血清样品同时电泳。将两种电泳图谱进行比较，判断纯度。 四、结果与计算 (一) r-球蛋白分离后6管收集液经检测结果记录如下： 双缩脲反应呈色深且不含NH4+的收集管液即为已脱盐的球蛋白液， 留作电泳鉴定。 (二) 蛋白质醋酸纤维薄膜电泳鉴定r-球蛋白纯度（与血清蛋白电泳对 照）。 五、注意事项 (一) 盐析时应逐滴加入饱和硫酸铵，边加边摇，静置要充分； (二) 装柱时柱内要严防断层与气泡，凝胶床面要平整； (三) 样品进入床内，打开出口应立即收集； (四) 作电泳时应注意的事项请参见第7章实验2。
有3种表示方法： 1、标准差 因分离过程中流出的曲线是正态分布曲线， 两侧拐点之间的距离为2个标准差。的计算：流 出峰到基线的距离为峰高的0.607倍，所以点峰 高0.607倍处为层析峰宽度的一半。大，说明组 分流出分散，层析峰宽度也大，是柱效不高的表现。 反之，小，表示组分在层析柱中集中，层析峰就 窄，柱效也高。 2、半峰宽() =2.354 3、峰宽(Wb) 是指通过层析峰两拐点作切线交于基线上 的截距。Wb=4。
层析技术的分类
一、按层析原理分类
吸附层析(Absorption Chromatography) 固定相是固体吸附 剂，利用各组分在吸附剂表面吸附能力的差别而进行分 离。 分配层析(Partition Chromatography) 固定相为液体，利用 各组分在两液相中分配系数的差别或溶解度不同使物质 分离。 离子交换层析(Ion Exchanger Chromatography) 固定相为 离子交换剂，利用各组分对离子交换剂的亲和力不同而 进行分离。 凝胶层析(Gel Chromatography) 固定相为多孔凝胶，利用 各组分在凝胶上受阻滞的程度不同而进行分离。 亲和层析(Affinity Chromatography) 根据生物特异性吸附进 行分离，固定相只和一种待分离组分有高度特异性的亲 和能力而结合，而与无结合能力的其他组分分离。
三.分离度(Rs)
指相邻两峰的保留差值是两峰宽平均值的几倍(图3-2)。
Rs tR 1 2
2
tR
1
(W 1 W 2 )
W1 W 2
Rs
tR W
若 Rs愈大，说明分离效果愈好。在实际分离过程中，各组分含量 不同，因而峰面积和峰宽在绝大多数情况下是不一致的，故一般用垂直 线法来计算。具体是连接两峰顶，再从两峰间的峰谷向基线作一垂线， f Rs g 此线和上述连线交于3处。从3到峰谷的距离为f，从3到基线距离为g (图 3-3)。
tR n 5 .54 1 W 2
2





本实验采用硫酸铵分段盐析法将家兔免疫血清中 的球蛋白与其它蛋白质分离，再经凝胶过滤法除盐 即可得到比较纯的球蛋白，最后用醋酸纤维薄膜电 泳法鉴定纯度，纯度较高者只出现一条球蛋白区带 并观察免疫前后球蛋白的变化。 三、操作步骤 (一) 盐析 1. 取免疫家兔血清及正常家兔血清各2.0ml分别加 入一支口径较粗的小试管中，加PBS液2.0ml摇匀。 再逐滴加入pH7.2饱和硫酸铵溶液2.0ml，边加边摇匀。 静置15min后，3000rpm离心10min。倾去上清液。 2. 将沉淀用1.0ml PBS液搅拌溶解，再逐滴加入饱 和硫酸铵液0.5ml，混匀。静置15min，3000rpm离心 10min。倾去上清液。沉淀用PBS液10滴搅拌溶解， 即为初步纯化的球蛋白溶液。
五.柱效



无论哪一种层析过程都是一个连续过程，各组分 在流动相和固定相之间不断进行分配，但无法具体计 算在某一点上的平衡情况。现以柱层析为例说明，某 一组分随流动相经过一定距离后，流动相中某组分的 平均浓度与固定相的平均浓度达到分配平衡，完成这 一平衡所需要的层析柱的柱长称为板高或理论塔板等 效高度，用H表示。一定柱长(L)中含有多少板高(H)称 为理论塔板数(n)，即： (n：理论塔板数，L：柱长，H：板高) 显然，H愈小，n就愈大，表明组分在两相间分 配次数也愈多，分离效果就好，柱效就高。因而习惯 上以塔板数的多少来衡量柱效的高低。塔板数的理论 推导和计算较复杂，已有专门书籍介绍。其最终以数 学公式表示： (tR：保留值，：标准差，W：峰宽)
家兔免疫血清 球蛋白分离与纯度鉴定
一、目的要求
1. 了解层析原理 2. 掌握醋酸纤维薄膜电泳技术
二、实验原理
层析技术是近代生物化学最常用的分离技术之一。 它是利用混合物中各组分的理化性质(吸附力、分子形状 和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等)的差异， 在两相运动中，不断地进行交换、分配、吸附及解吸附 等过程，可将各组分间的微小差异经过相同的重复过程 而达到分离。配合相应的光学、电学和电化学检测手段， 可用于定性、定量和纯化某种物质，其纯度高达99%。 层析法的特点是分离率、灵敏度(pg-fg级)、选择性均高 的一种分离方法。尤其适合样品含量少，而杂质含量多 的复杂生物样品的分析。 无论哪种层析均由固定相和流动相组成。固定相可 以是固体也可以是液体，但这个液体必须附载在某个固 体物质上，该物质称载体或担体(Support)。同样流动相 可以是液体也可以是气体。
二、按操作方式不同分类
纸层析(Paper Chromatography) 以滤纸作为液体的载体， 点样后，用流动相展开，以达到组分分离目的。 薄层层析(Thin Layer Chromatography) 以一定颗粒度的 不溶性物质，均匀涂铺在薄板上，点样后，用流动相展 开，使组分达到分离。 柱层析(Column Chromatography) 将固定相装柱后，使样 品沿一个方向移动，以达到分离目的。





(二) 脱盐 1. 装柱：取1.515cm 层析柱1 支（若底部无烧结板，用一小块海绵或 棉花堵住下端）装入约1/3柱高的蒸馏水，排除底部死腔气泡，至剩余约 2～3cm柱高的水时关闭出口。沿柱内壁缓慢灌入稀糊状葡聚糖凝胶G25 悬液至2/3柱高，严防气泡及断层。待分层后打开出口，当水全部进入床 面以后，沿柱内壁缓慢加入PBS液共约8ml，平整床面，待液面恰好与床 面重合时，关闭出口。 2. 加样与洗脱：用细长滴管吸取球蛋白溶液，在靠近床面处沿柱内壁 缓缓加入（注意勿破坏床面），打开出口，调节流速为5滴/分。待球蛋 白液完全进入床面后，先加少量PBS液（约1ml），待其全部进入床面， 再用PBS液进行洗脱。 3. 收集：取小试管6支编号。依次立即收集上述洗脱液，每管收集0.5ml （约12滴），共收集6管，关闭出口。 4. 检测：准备干净的白瓷板两块，分别于各凹槽内依次放相应管收集液 各1滴。向其中一块板各凹槽内加钠氏试剂1滴，有NH4+者出现棕红色沉 淀；向另一白瓷板各凹槽内加双缩脲试剂1滴，有蛋白质者呈现双缩脲颜 色（蓝紫色）反应。均以“+”或“”号记录之。 双缩脲反应呈色深且不含NH4+的收集管液即为已脱盐的球蛋白液。取 该液浓缩（每0.5ml加葡聚糖凝胶G25颗粒0.1g，摇匀后静置分层）备用。