2015年药典无菌检查(常州培训)

Ø 注：菌悬液在室温下2h使用,若保存在2 ～8 ℃可在24小时内使用。
2020年1月
228
9.3 培养基灵敏度检查
培养基灵敏度检查使用6株菌见下表
2020年1月
229
9.4 培养基适用性检查
培养基接种
金黄色葡萄球菌2支
硫乙醇酸盐流体培养基
铜绿假单胞菌2支
12ml（7支）
生孢梭菌2支
空白对照1支 分别接种小于100cfu金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌、生孢梭菌 菌悬液各2支,另1支不接种作为空白对照,培养3天，逐日观察结果。
3)方法适用性试验按“供试品的无菌检查”的规 定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进 行方法确认。
2020年1月
333
10.1 方法适用性试验
菌种及菌液制备 ：除大肠埃希菌
（Escherichia coli）[CMCC(B) 4 4102〕外，
金黄色葡萄球菌 、 枯草芽孢杆菌 、 生孢梭 菌、 白色念珠菌、黑曲霉同培养基灵敏度检查。
2020年1月
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注：10倍梯度稀释；选择适宜的3个稀释级别；要求＜100cfu/ml。
2020年1月
227
9.2 培养基适用性检查
菌液制备
Ø 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪 大豆胨液体基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物 至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18 ～24h；
Ø供试品检查时，培养基的用量和高度同方法适 用性试验。
2020年1月
224
9、培养基适用性检查
Ø 无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨 液体培养基等应符合培养基的无菌检查及灵敏度检 查的要求。
Ø 无菌性检查：每批培养基随机取不少于5支（瓶）， 置培养基规定的温度培养14天，应无菌生长。
Ø 灵敏度检查：用于培养基灵敏度检查所用的菌株传 代不得超过5代（从菌种保存中心获得的干燥菌种 为0代），采用适宜的方法保存；并以保证试验菌 株的生物学特性。
2020年1月
441
11.5 供试品的无菌检查
例如：
Ø 水溶性供试品：取规定量，直接过滤，或混合至含不少 于100ml适宜稀释的无菌容器中，混匀，立即过滤。 如供试品具有抑菌作用，须用冲洗液冲洗滤膜。冲洗次 数不少于三次，所用的冲洗量、冲洗方法同方法适用性 试验。除生物制品外，一般样品冲洗后，1份滤器加入 100ml硫乙醇酸盐流体培养基，1份滤器加入100ml胰 酪大豆胨液体培养基。
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试验设备（7）-生物安全柜
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试验设备（8）Equinox 全自动无菌检验系统
2020年1月
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8、 培养基种类及用途
Ø 硫乙醇酸盐流体基（主要用于厌气菌培养、也可用于
需氧菌培养）
Ø 胰酪大豆胨液体基（用于真菌和需氧菌培养）
2020年1月
220
8.1 培养基配制及要求
2. 无菌试验过程中，若需试验表面活性剂、中和 剂，应证明其有效性，且对微生物无毒性。
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11.1 供试品无菌检查
2020年1月
38
11.2 供试品的无菌检查
阳性对照应根据供试品特性选择阳性对照菌：
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39
11.3 供试品的无菌检查
阴性对照 ： 供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液
Ø 结果判断 空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管试 验菌生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合 规定。
2020年1月
332
10. 方法适用性试验
试验目的: 1)进行无菌检查时，应进行方法适应性试验，以确
认所采用的方法适合于该产品的无菌检查；
2)若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果 时，应重新进行方法适用性试验；
2020年1月
225
9.1 培养基适用性检查
菌种：试验用菌株及菌液制备：
① 金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003 ② 铜绿色假单胞菌[CMCC(B)10104] ③ 枯草杆菌[CMCC(B)63501] ④ 生孢梭菌[CMCC(B)64941] ⑤ 白色念珠菌[CMCC(F)98001] ⑥ 黑曲霉[CMCC(F)98003]
2020年1月
42
11.6供试品的无菌检查
Ø 水溶性固体供试品：取规定量，加适宜的稀释液溶 解或按标签说明复溶，然后按水溶液供试品项下的 方法进行操作。
Ø 具有导管的医疗器具（输血、输液袋等）供试品： 取规定量，每个小包装用50-100ml冲洗液分别冲 洗内壁，收集冲洗液于无菌容器中，然后照水溶液 供试品项下方法操作。同时应采用直接接种法进行 包装中所配带的针头的无菌检查。
2020年1月
8
6.1实验环境洁净度要求（修改）
2020年1月
9

6.2 实验环境人员要求：
• 菌检人员必须具备微生物专业知识，并 经过无菌技术培训。
2020年1月
110
7 、试验主要设备
Ø 细菌培养箱 Ø 霉菌培养箱 Ø 超净工作台 Ø 可调温的培养箱 Ø 显微镜 Ø 台式高压蒸汽灭菌器 Ø 立式高压蒸汽灭菌器 Ø 电热恒温干燥箱 Ø 集菌仪
2020年1月
111
试验仪器（1） - 超净工作台
2020年1月
112
试验设备（2）--隔水式恒温培养箱
113 2020年1月
试验设备（3）----霉菌培养箱
2020年1月
114
试验设备（4）-立式高压蒸汽灭菌器
2020年1月
115
试验设备（5）--台式蒸汽灭菌器
2020年1月
116
试验设备（6）-- 显 微 镜
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11.7 供试品的无菌检查
Ø 具有导管的医疗器具（输血、输液袋等）供试品：取 规定量，每个小包装用50-100ml冲洗液分别冲洗内 壁，收集冲洗液于无菌容器中，然后照水溶液供试品 项下方法操作。同时应采用直接接种法进行包装中所 配带的针头的无菌检查。
2020年1月
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11.8 供试品无菌检查
2020年1月
33接种
枯草芽孢杆菌 2支
胰酪大豆胨液体基 白色念株菌 2支
9ml（7支）
黑曲霉 2支
空白对照1支
每分别接种小于100cfu枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2 支,另1支不接种作为空白对照,培养5天，逐日观察结果。
2020年1月
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9.6 培养基适用性检查
Ø 水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤润湿滤膜。油类供 试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥，为发挥滤膜最大 过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。 供试品经薄膜过滤后，若需要冲洗液冲洗滤膜。每张滤膜每次 冲洗量为100ml.,且总冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜上 的微生物受损伤。
1)增加冲洗量，或增加培养基的用量；
2)使用中和剂，或更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌
作用，并重新进行方法适用性试验。
注：方法适用性试验也可与供试品的无菌检查同时进行。
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11、供试品的无菌检查
1. 无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。
1. 供试品无菌检查所采用的检查和检验条件应与 方法适用性试验确认的方法相同。
Ø 硫乙醇酸盐培养基：置30～35℃培养。
2020年1月
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8.3 培养基配制及要求
Ø 胰酪大豆胨液体基：取培养基成分混合，微温溶解，滤 过，调节PH值约为7.3±0.2，加入葡萄糖，摇匀，分装， 灭菌。
Ø 胰酪大豆胨液体基：置20～25℃培养。
2020年1月
223
8.4 培养基配制及要求
培养基装量： Ø对于采用直接接种法检查的供试品，应根据供 试品接种量确定培养基的装量，每个容器中培 养基的用量应符合接种的供试品体积不大于培 养基体积的10%。
➢ 无菌检查法 ：用于检查药典要求无菌的药品、 生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种 是否无菌的一种方法。
2020年1月
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3、无菌操作及无菌技术要求
无菌操作
是指在无菌环境条件下，在对无菌制品或无菌器械等进行 检验的过程中，能防止微生物污染与干扰的一种常规操 作方法。
无菌技术
是指在微生物试验工作中，控制或防止各类微生物的污染 及其他干扰的一系列操作方法和有关措施，无菌试验器
材及无菌操作。
2020年1月
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4、无菌检查法的局限性
若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试 品在该检验条件下未发现微生物污染。
2020年1月
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5、 医疗器具无菌检验依据
Ø 本规范选用于《中国药典》2015年版 四部 1101 无菌检查法。
Ø GB/T 14233.2-2005 《医用输液、输血、注射 器具检验方法 ，第二部分：生物试验方法中规定 的无菌试验方法。
、冲洗液同法操作，作为阴性对照； 阴性对照不得有菌生长。
2020年1月
440
11.4 供试品的无菌检查
薄膜过滤法：
Ø 薄膜过滤法应采用封闭式薄膜过滤器。无菌检查用的滤膜孔径 应不大于0.45μm，直径约为50 mm。根据供试品及其溶剂的 特性选择滤膜材质。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。
2020年1月
7
6、实验环境条件要求
• 2015药典无菌检查：应在无菌条件下进行，试验环 境必须达到无菌检查的要求，检验全过程应严格遵 守无菌操作，防止微生物污染，防止微生物污染的 措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气 区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区) 悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国 家标准进行洁净度验证。隔离系统按相关的要求进 行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要 求。
2020年1月
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1、无菌产品理念
灭菌产品的无菌保证不能依赖最终产品的无 菌检验，它是作为确定批无菌产品是否无菌 的一个检验项目，而产品的无菌保证要取决 于生产过程中采用合格的灭菌工艺、良好的 无菌保证体系和严格的GMP管理。
2020年1月
3
2 、无菌和无菌检查法概念
➢ 无菌 ：是指某一物体或某一环境中不含有活 的微生物。
直接接种法：
适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品，即取规定量供试品 分别等量接种至硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基中。 除生物制品外，一般样品无菌检查时两种培养基接种的支/瓶数相等； 生物制品无菌检查时硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基 接种的支/瓶数为2：1。除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符 合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%，同时，硫乙醇酸盐 流体培养基每管装量不少于15ml，胰酪大豆胨液体培养基每管装量不 少于10ml。供试品检查时，培养基的用量和高度同方法适用性试验。
Ø 接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼 脂培养基上， 20～25℃培养24 ～48h，上述培养物用pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌量小于100cfu菌悬 液；
Ø 接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上， 20～25℃培 养5 ～ 7天，加入3～ 5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯 化钠溶液，将孢子洗脱。然后采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管中， 用含0.05%（V/V）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子 数小于100cfu孢子悬液；（如表9.3）
2015药典-无菌检查
江苏省医疗器械检验所
2020年1月
1
主要内容
1. 无菌产品理念 2. 无菌和无菌检查法概念 3. 无菌操作及无菌技术要求 4. 无菌检查法的局限性 5. 医疗器具无菌检验依据 6. 实验环境条件及人员要求 7. 试验主要设备 8. 培养基种类用途及配制要求 9. 培养基适用性检查 10. 方法适用性试验 11. 供试品的无菌检查
注：大肠埃希菌的菌液制备同金黄色葡萄球菌。
2020年1月
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10.2 方法适用性试验
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10.3 方法适用性试验
结果判断
与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好 ，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或 其抑菌作用可以忽略不计，照此检查法和检验条件进行供 试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中试验菌生长微 弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条 件下有抑菌作用。可采用：
Ø 培养基的灭菌 ：配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。 保存时间：制备好的培养基应保存在：2 ～25℃、避光环 境。
Ø 非密闭容器中：一般在三周内使用； Ø 密闭容器中：一般可在一年内使用。
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8.2 培养基配制及要求
Ø 硫乙醇酸盐培养基：配制后调节PH值为弱碱 性，使灭菌后在25 ℃的pH为7.1±0.2，分 装在适宜的容器中，其装量与容器高度的比 列应符合培养后培养基氧化层（粉红色）不 超过培养基深度1/2。灭菌。在供试品接种 前，培养基的氧化层（粉红色）的高度不得 超过培养基深度的1／5，否则，须经100℃ 水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟）， 迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。