体内药物分析第4章 体内药物分析方法的建立与验证
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4. 与参比方法的相关性 参比方法一般选用特异性强、准确度高、线性关系 良好的色谱法。
例：茶碱血浆样品用UV法和HPLC法测定结果的相关 性
HPLC
茶 14 碱 血 12 浆 样 品 10 用
8
法6 测 定4 的 结 果2
.
.
. Y=－0.107＋0.983X
.
(r=0.9591，n=9)
. .
. ..
分析方法的建立步骤： 第一步：检测条件的筛选
以待测药物对照品照拟定的分析方法 （预处理除外）测定。根据测定结果确定最 佳分析检测条件。
例：HPLC－检测器、色谱柱、流动相、柱 温、内标；使具有足够的方法灵敏度、良好 的色谱参数（n，R，T）、适当保留时间。
第二步：分离条件的筛选
在进行分离条件筛选时，应考察生物 基质中内源性物质及代谢产物对分离与检 测的干扰；确认以对照品确定的检测条件 是否适用于实际生物样品。
分析测定的目的与要求
根据体内药物分析的目的决定分析方法的应用 1. 药代动力学研究
要求: 同时测定原形药物和代谢产物 检测: 宽线性范围（Cmax~Cmax的1/20）、高灵敏
度（10-9g/ml）和高专属性 方法: 不必强调方法的简便、快速；重点考虑测定 浓度范围较宽；多采用HPLC、GC-MS、LC-MS
考察目标：代谢产物对药物、内标物质的干 扰情况，进一步验证方法的可行性。
分离条件选择色谱图：
第三节 分析方法验证的内容与要求
验证分析方法的可行性与可靠性 方法验证时应考虑影响分析方法所有可变 因素（采样，样品制备，色谱分离，检测 与数据评价），通常采用模拟生物样品和 实际生物样品。
分析方法验证的内容：
SD
n
(Xi X )2
i 1
n 1
RSD SD 100% X
批内（within-run or intea-assay）RSD 批间（between-run or inter-assay）RSD 日内（within-day）；日间（between-day）
测定法： 取空白生物基质（血浆）数份，分别
第四章 体内药物分析方法的
建立与验证
第一节 分析方法的设计依据
一、分析方法的设计依据
1. 系统检索国内外的科技文献： 2. 了解待测药物的理化性质； 3. 药物在生物体内的存在状况； 4. 药代动力学参数； 5. 分析检测方法
二、建立分析检测方法的主要依据
1. 待测药物的理化性质及体内存在状况 2. 分析测定的目的与要求 3. 生物样品的类型与样品制备方法 4. 实验室条件
1. 药物的理化性质及体内存在状况
选择预处理方法 药物理化性质 药物在体内存在状态 代谢途径及代谢物性质
待测药物的理化性质
亲脂性；药物的pKa值；水和有机溶剂中的溶 解度及分配系数。 萃取方法和萃取条件的选择 亲脂性：在适当的pH值下用有机溶剂萃取 强极性或亲水性：沉淀蛋白、固相萃取、离子
对萃取或衍生化后萃取 挥发性：极性小有机溶剂萃取。
1. 标准系列溶液的制备 2. 内标溶液的制备 3. 标准系列模拟生物样品的制备 4. 标准曲线的绘制
注意事项： 1. 溶剂－水或甲醇 2. 标准曲线至少含6个浓度点（不包括零点）可覆盖全
部 待测生物样品的药物浓度。 3. 标准曲线各浓度点等比梯度模式（比例常数约为2）
如： 1，2，5，10，20，50，100；实际制备时可先配高浓度 依次稀释：100，50，20，10，5，2，1。 4. 浓度－加入的标准系列溶液的浓度应模拟生物样品中 药物浓度的50倍以上，加入量为生物样品总体积2％以
在同一批内或不同批间制备高、中、低3个 浓度的QC样品，并分析测定。
测定批内RSD（日内）： 同一分析批内，用同一标准曲线同一实
验条件下测定；每一浓度5～6个样品，每个 样品测定1次，用随行标准曲线分别计算3个 浓度及每一浓度的RSD。
测定－批间RSD（日间）： 至少5个工作日内完成。每个工作日内
2 4 6 8 10 12 14 茶碱血浆样品用UV法测定的结果
三、标准曲线与线性范围
标准曲线： 生物样品中所测定药物浓度与响应的相关性，
通常用回归分析法（最小二乘法或加权最小二乘 法）获得标准曲线。标准曲线通常为线性模式。 推荐文献：钟大放，以加权最小二乘法建立生物 分析标准曲线的若干问题；药物分析杂志：1996， 16（5）：343－346
2. 临床治疗药物监测： 测定有效治疗浓度范围内药物浓度；
分析方法尽量简便易行、快速，适用于长 期、批量样品；大多采用UV、RIA或EIA 等。
3．中毒患者的临床抢救 药物浓度极高，不必强调方法的灵敏
度，特别强调方法特异性，速度快；大多 采用GC、GC-MS、RIA或EIA。
生物样品类型与预处理方法
HPLC色谱峰的tR、n一致及与内源性物质 色谱峰的R合乎要求。确证内源性物质对分 析方法有无干扰。
2.代谢产物的干扰
比较模拟生物样品和用药后的实际生物样
品的检测信号（tR、n、和R）是否一致；
确证代谢产物对分析方法有无干扰。
3.伍用药物的干扰 TDM时，考虑患者可能同时服用药物的干扰，比
较待测药物、同时服用药物、模拟生物样品和添加 同时服用药物的模拟干扰样品的检测信号。确证同 时服用药物对分析方法的干扰情况。
线性范围（linear rang）： 标准曲线的最高与最低浓度的区间，
在线性范围内药物浓度测定结果应达到试 验要求的精密度和准确度。
标准系列溶液的制备： 用模拟生物样品建立（空白血浆＋待测药 物的对准品）
注意： 建立标准曲线所使用的模拟生物样品
应使用与待测的含药生物样品相同生物基 质制备。
标准曲线的一般建立方法：
四、精密度（precision）
系指每次测定结果与多次测定的平均 值的偏离程度。
表示该分析方法的可重复性，可反映 分析方法的可操作性，是方法验证的基 本要点之一。
使用模拟生物样品测定。
标准偏差（standard deviation，SD） 相对标准偏差（relative standard deviation, RSD）
LOQ限度要求：至少能满足测定3－5个半 衰期后生物样品中的药物浓度（或能检测 出Cmax的1/10~1/20时的药物浓度）
受试药物的Cmax ：3.202±0.496ug/ml LOQ为0.1ug/ml＜0.16ug/ml（Cmax的1/20） 且RSD＜20％，RE％ ＜20％
六、稳定性
方法稳定性： 1. 待测药物及其分析溶液在实验室的温度、湿 度、光照及暴露空气等条件下的稳定性 2. 模拟生物样品在预处理过程中的稳定性 3. 提纯后的残渣及其复溶溶液的稳定性
一、分析方法的选择
生物样品中药物浓度是决定分析方法的首 要因素：药物或其特定代谢产物浓度低、样 品量少，难以通过增加取样量提高方法灵敏 度，只能通过选择适当的分析方法适应样品 分析需求。
二、分析方法的建立
初步拟定分析方法 通过大量试验工作，选择最佳分析条 件， 建立分析方法。
分析方法的验证 分析方法的建立与分析方法的验证紧密 相关。
生物样品稳定性：
1. 短期稳定性：室温、4℃或－20℃以及冻－融 循环条件下的稳定性
是保证被测药物具有一定准确度、精密度的前 提下，该分析方法能够准
确测定生物样品中药物的最低浓度（通常为标 准曲线上的最低浓度点）。
样品制备：取空白血浆，制备至少5个独立的 QC样品
测定方法：其浓度应使S/N≥10，同时进行准确 度和精密度验证。
LOQ的准确度应在真实浓度的80％～120％ 范围内；精密度的RSD应小于20％；
考察目标：生物基质中内源性物质对测定 的干扰（方法特异性）。
要求在待测药物（或活性代谢物、内 标物质）的信号附近的有限范围内不应出 现内源性物质信号。
3.模拟生物样品试验（方法的效能指标） 取空白生物基质加入待测药物制成模
拟生物样品，照“空白生物基质试验”项 下方法试验。
考察目标：方法的线性范围、精密度与准 确度、灵敏度、药物的萃取回收率、特异 性（内源性物质的干扰）等各项技术指标。
8. 标准曲线的限度要求：
药代动力学或生物利用度研究：最高浓度应高于 达峰浓度（Cmax）；最低浓度应低于Cmax的 1/10~1/20，并应为方法的LOQ
例：若体内平均达峰浓度为50ng/ml ，其1/20为 2.5ng/ml，设定最高浓度为100ng/ml ，最低浓度 为1ng/ml（个体差异）
药物稳定性
萃取浓缩技术 对酸碱不稳定－避免使用强酸或强碱溶剂 对热不稳定－避免高温蒸发溶剂 对光不稳定－避光操作
待测药物的体内存在状态
与血浆蛋白结合的强弱及结合率的高低影响 分离萃取方பைடு நூலகம்：蛋白结合较强不宜直接用溶剂萃 取。
体内浓度高低、代谢过程及其代谢产物决定 分析检测技术：浓度较低（尤其有代谢成分共 存）考虑代谢产物的干扰应选择高灵敏度、高选 择性测定方法（LC-MS , EIA）
特异性 线性范围 精密度与准确度 定量限与检测限 稳定性
分析方法的验证
一、方法特异性（专属性或选择性）
方法的特异性（specificity）： 系指当有内源性物质存在时，方法准
确测定待测物质（药物、代谢物）的能力， 表示所检测的信号属于待测物所特有。
1.内源性物质的干扰 比较待测药物对照品、空白生物基质、模 拟生物样品的检测信号。
色谱分析法： 还要考察待测药物（或内标物）与内源
性物质（或其它药物）的分离情况。 －色谱峰的保留时间、理论塔板数和拖尾 因子是否与水溶液一致 －色谱峰是否为单一成分 －标准曲线的截距是否显著偏离零点
4. 实际生物样品测试－进一步验证内源性物质、代 谢产物的干扰
经空白生物基质和模拟生物样品试验后，确 定的分析方法及其条件，不能完全确认是否适合 于实际生物样品的测定，因为药物在体内可能与 内源性物质结合（如血浆蛋白结合物）或代谢生 成数个代谢产物及其进一步的结合物（或缀合 物）。
5. 步骤： （1）先加入标准溶液 （2）再加入空白生物基质 （3）涡旋混匀
6. 内标溶液的浓度：加入的内标溶液的浓度应为标 准系列浓度的中间浓度
7. 标准曲线的绘制：以待测药物的检测信号（如色 谱峰峰面积或峰高），内标法药物的检测响应应 与内标物质检测响应的比值（因变量y）对模拟血 药浓度（自变量x）求得回归方程y=ax+b，相关系 数（r）。回归方程的截距应接近于零，r≥0.99 （色谱法）
完成3个浓度（高、中、低），每一浓度1 个样品，用随行标准曲线计算日间RSD。
限度要求： 在药代动力学和生物利用度研究中
RSD一般应≤15％ 在LOQ附近RSD应≤20％。
准确度和精密度可采用同一组数据， 采用不同数据处理方法计算结果：
五、定量限
（limit of quantitation,LOQ）
以血浆或血清为分析样品: HPLC检测－采用蛋白沉淀-溶剂萃取预处
理技术。 RIA分析－样品的预处理方法可较为粗
放，经简单蛋白沉淀或不经预 处理直接测定。
实验室条件
实验室现有的或有可能在其它实验室使 用的仪器装备，合理选择可行的分析方法。
第二节 分析方法建立的一般步骤
分析方法的选择 分析方法的建立 检测条件的筛选 分离条件的筛选
一般用相对回收率（relative recovery，RR）或 相对误差（relative error , RE）表示。
相对回收率＝M 100% A
相对偏差＝M A 100% A
测定值M，添加量A。
限度要求：
相对回收率 85％～115％（LOQ附近80％～120％）
RE ±15％（LOQ附近±20％）
三、准确度（accuracy）
指用该方法测得的生物样品中待测药 物浓度与其真实浓度的接近程度
通常使用模拟生物样品测定（空白 血浆＋浓度已知的对照品溶液），以测 得的浓度与添加浓度比较计算。
测定法：
取空白生物基质数份，在标准曲线范 围制备高（接近上限）、中、低（接近 LOQ）3个浓度，每一浓度至少5个样品， 与随行的标准曲线同法测定，以测得的浓 度与加入对照品溶液浓度比较计算。
筛选分离条件步骤：
1. 空白溶剂试验（方法特异性） 待测药物的非生物基质溶液（水溶液）
采用拟定方法进行预处理，并测定响应信 号。
考察目标：预处理（衍生化反应、萃取 分离）不干扰药物的测定。
2. 空白生物基质试验（方法的特异性） 取空白生物基质，如空白血浆，用拟
定的方法，照“空白溶剂试验”项下方法 操作。
例：茶碱血浆样品用UV法和HPLC法测定结果的相关 性
HPLC
茶 14 碱 血 12 浆 样 品 10 用
8
法6 测 定4 的 结 果2
.
.
. Y=－0.107＋0.983X
.
(r=0.9591，n=9)
. .
. ..
分析方法的建立步骤： 第一步：检测条件的筛选
以待测药物对照品照拟定的分析方法 （预处理除外）测定。根据测定结果确定最 佳分析检测条件。
例：HPLC－检测器、色谱柱、流动相、柱 温、内标；使具有足够的方法灵敏度、良好 的色谱参数（n，R，T）、适当保留时间。
第二步：分离条件的筛选
在进行分离条件筛选时，应考察生物 基质中内源性物质及代谢产物对分离与检 测的干扰；确认以对照品确定的检测条件 是否适用于实际生物样品。
分析测定的目的与要求
根据体内药物分析的目的决定分析方法的应用 1. 药代动力学研究
要求: 同时测定原形药物和代谢产物 检测: 宽线性范围（Cmax~Cmax的1/20）、高灵敏
度（10-9g/ml）和高专属性 方法: 不必强调方法的简便、快速；重点考虑测定 浓度范围较宽；多采用HPLC、GC-MS、LC-MS
考察目标：代谢产物对药物、内标物质的干 扰情况，进一步验证方法的可行性。
分离条件选择色谱图：
第三节 分析方法验证的内容与要求
验证分析方法的可行性与可靠性 方法验证时应考虑影响分析方法所有可变 因素（采样，样品制备，色谱分离，检测 与数据评价），通常采用模拟生物样品和 实际生物样品。
分析方法验证的内容：
SD
n
(Xi X )2
i 1
n 1
RSD SD 100% X
批内（within-run or intea-assay）RSD 批间（between-run or inter-assay）RSD 日内（within-day）；日间（between-day）
测定法： 取空白生物基质（血浆）数份，分别
第四章 体内药物分析方法的
建立与验证
第一节 分析方法的设计依据
一、分析方法的设计依据
1. 系统检索国内外的科技文献： 2. 了解待测药物的理化性质； 3. 药物在生物体内的存在状况； 4. 药代动力学参数； 5. 分析检测方法
二、建立分析检测方法的主要依据
1. 待测药物的理化性质及体内存在状况 2. 分析测定的目的与要求 3. 生物样品的类型与样品制备方法 4. 实验室条件
1. 药物的理化性质及体内存在状况
选择预处理方法 药物理化性质 药物在体内存在状态 代谢途径及代谢物性质
待测药物的理化性质
亲脂性；药物的pKa值；水和有机溶剂中的溶 解度及分配系数。 萃取方法和萃取条件的选择 亲脂性：在适当的pH值下用有机溶剂萃取 强极性或亲水性：沉淀蛋白、固相萃取、离子
对萃取或衍生化后萃取 挥发性：极性小有机溶剂萃取。
1. 标准系列溶液的制备 2. 内标溶液的制备 3. 标准系列模拟生物样品的制备 4. 标准曲线的绘制
注意事项： 1. 溶剂－水或甲醇 2. 标准曲线至少含6个浓度点（不包括零点）可覆盖全
部 待测生物样品的药物浓度。 3. 标准曲线各浓度点等比梯度模式（比例常数约为2）
如： 1，2，5，10，20，50，100；实际制备时可先配高浓度 依次稀释：100，50，20，10，5，2，1。 4. 浓度－加入的标准系列溶液的浓度应模拟生物样品中 药物浓度的50倍以上，加入量为生物样品总体积2％以
在同一批内或不同批间制备高、中、低3个 浓度的QC样品，并分析测定。
测定批内RSD（日内）： 同一分析批内，用同一标准曲线同一实
验条件下测定；每一浓度5～6个样品，每个 样品测定1次，用随行标准曲线分别计算3个 浓度及每一浓度的RSD。
测定－批间RSD（日间）： 至少5个工作日内完成。每个工作日内
2 4 6 8 10 12 14 茶碱血浆样品用UV法测定的结果
三、标准曲线与线性范围
标准曲线： 生物样品中所测定药物浓度与响应的相关性，
通常用回归分析法（最小二乘法或加权最小二乘 法）获得标准曲线。标准曲线通常为线性模式。 推荐文献：钟大放，以加权最小二乘法建立生物 分析标准曲线的若干问题；药物分析杂志：1996， 16（5）：343－346
2. 临床治疗药物监测： 测定有效治疗浓度范围内药物浓度；
分析方法尽量简便易行、快速，适用于长 期、批量样品；大多采用UV、RIA或EIA 等。
3．中毒患者的临床抢救 药物浓度极高，不必强调方法的灵敏
度，特别强调方法特异性，速度快；大多 采用GC、GC-MS、RIA或EIA。
生物样品类型与预处理方法
HPLC色谱峰的tR、n一致及与内源性物质 色谱峰的R合乎要求。确证内源性物质对分 析方法有无干扰。
2.代谢产物的干扰
比较模拟生物样品和用药后的实际生物样
品的检测信号（tR、n、和R）是否一致；
确证代谢产物对分析方法有无干扰。
3.伍用药物的干扰 TDM时，考虑患者可能同时服用药物的干扰，比
较待测药物、同时服用药物、模拟生物样品和添加 同时服用药物的模拟干扰样品的检测信号。确证同 时服用药物对分析方法的干扰情况。
线性范围（linear rang）： 标准曲线的最高与最低浓度的区间，
在线性范围内药物浓度测定结果应达到试 验要求的精密度和准确度。
标准系列溶液的制备： 用模拟生物样品建立（空白血浆＋待测药 物的对准品）
注意： 建立标准曲线所使用的模拟生物样品
应使用与待测的含药生物样品相同生物基 质制备。
标准曲线的一般建立方法：
四、精密度（precision）
系指每次测定结果与多次测定的平均 值的偏离程度。
表示该分析方法的可重复性，可反映 分析方法的可操作性，是方法验证的基 本要点之一。
使用模拟生物样品测定。
标准偏差（standard deviation，SD） 相对标准偏差（relative standard deviation, RSD）
LOQ限度要求：至少能满足测定3－5个半 衰期后生物样品中的药物浓度（或能检测 出Cmax的1/10~1/20时的药物浓度）
受试药物的Cmax ：3.202±0.496ug/ml LOQ为0.1ug/ml＜0.16ug/ml（Cmax的1/20） 且RSD＜20％，RE％ ＜20％
六、稳定性
方法稳定性： 1. 待测药物及其分析溶液在实验室的温度、湿 度、光照及暴露空气等条件下的稳定性 2. 模拟生物样品在预处理过程中的稳定性 3. 提纯后的残渣及其复溶溶液的稳定性
一、分析方法的选择
生物样品中药物浓度是决定分析方法的首 要因素：药物或其特定代谢产物浓度低、样 品量少，难以通过增加取样量提高方法灵敏 度，只能通过选择适当的分析方法适应样品 分析需求。
二、分析方法的建立
初步拟定分析方法 通过大量试验工作，选择最佳分析条 件， 建立分析方法。
分析方法的验证 分析方法的建立与分析方法的验证紧密 相关。
生物样品稳定性：
1. 短期稳定性：室温、4℃或－20℃以及冻－融 循环条件下的稳定性
是保证被测药物具有一定准确度、精密度的前 提下，该分析方法能够准
确测定生物样品中药物的最低浓度（通常为标 准曲线上的最低浓度点）。
样品制备：取空白血浆，制备至少5个独立的 QC样品
测定方法：其浓度应使S/N≥10，同时进行准确 度和精密度验证。
LOQ的准确度应在真实浓度的80％～120％ 范围内；精密度的RSD应小于20％；
考察目标：生物基质中内源性物质对测定 的干扰（方法特异性）。
要求在待测药物（或活性代谢物、内 标物质）的信号附近的有限范围内不应出 现内源性物质信号。
3.模拟生物样品试验（方法的效能指标） 取空白生物基质加入待测药物制成模
拟生物样品，照“空白生物基质试验”项 下方法试验。
考察目标：方法的线性范围、精密度与准 确度、灵敏度、药物的萃取回收率、特异 性（内源性物质的干扰）等各项技术指标。
8. 标准曲线的限度要求：
药代动力学或生物利用度研究：最高浓度应高于 达峰浓度（Cmax）；最低浓度应低于Cmax的 1/10~1/20，并应为方法的LOQ
例：若体内平均达峰浓度为50ng/ml ，其1/20为 2.5ng/ml，设定最高浓度为100ng/ml ，最低浓度 为1ng/ml（个体差异）
药物稳定性
萃取浓缩技术 对酸碱不稳定－避免使用强酸或强碱溶剂 对热不稳定－避免高温蒸发溶剂 对光不稳定－避光操作
待测药物的体内存在状态
与血浆蛋白结合的强弱及结合率的高低影响 分离萃取方பைடு நூலகம்：蛋白结合较强不宜直接用溶剂萃 取。
体内浓度高低、代谢过程及其代谢产物决定 分析检测技术：浓度较低（尤其有代谢成分共 存）考虑代谢产物的干扰应选择高灵敏度、高选 择性测定方法（LC-MS , EIA）
特异性 线性范围 精密度与准确度 定量限与检测限 稳定性
分析方法的验证
一、方法特异性（专属性或选择性）
方法的特异性（specificity）： 系指当有内源性物质存在时，方法准
确测定待测物质（药物、代谢物）的能力， 表示所检测的信号属于待测物所特有。
1.内源性物质的干扰 比较待测药物对照品、空白生物基质、模 拟生物样品的检测信号。
色谱分析法： 还要考察待测药物（或内标物）与内源
性物质（或其它药物）的分离情况。 －色谱峰的保留时间、理论塔板数和拖尾 因子是否与水溶液一致 －色谱峰是否为单一成分 －标准曲线的截距是否显著偏离零点
4. 实际生物样品测试－进一步验证内源性物质、代 谢产物的干扰
经空白生物基质和模拟生物样品试验后，确 定的分析方法及其条件，不能完全确认是否适合 于实际生物样品的测定，因为药物在体内可能与 内源性物质结合（如血浆蛋白结合物）或代谢生 成数个代谢产物及其进一步的结合物（或缀合 物）。
5. 步骤： （1）先加入标准溶液 （2）再加入空白生物基质 （3）涡旋混匀
6. 内标溶液的浓度：加入的内标溶液的浓度应为标 准系列浓度的中间浓度
7. 标准曲线的绘制：以待测药物的检测信号（如色 谱峰峰面积或峰高），内标法药物的检测响应应 与内标物质检测响应的比值（因变量y）对模拟血 药浓度（自变量x）求得回归方程y=ax+b，相关系 数（r）。回归方程的截距应接近于零，r≥0.99 （色谱法）
完成3个浓度（高、中、低），每一浓度1 个样品，用随行标准曲线计算日间RSD。
限度要求： 在药代动力学和生物利用度研究中
RSD一般应≤15％ 在LOQ附近RSD应≤20％。
准确度和精密度可采用同一组数据， 采用不同数据处理方法计算结果：
五、定量限
（limit of quantitation,LOQ）
以血浆或血清为分析样品: HPLC检测－采用蛋白沉淀-溶剂萃取预处
理技术。 RIA分析－样品的预处理方法可较为粗
放，经简单蛋白沉淀或不经预 处理直接测定。
实验室条件
实验室现有的或有可能在其它实验室使 用的仪器装备，合理选择可行的分析方法。
第二节 分析方法建立的一般步骤
分析方法的选择 分析方法的建立 检测条件的筛选 分离条件的筛选
一般用相对回收率（relative recovery，RR）或 相对误差（relative error , RE）表示。
相对回收率＝M 100% A
相对偏差＝M A 100% A
测定值M，添加量A。
限度要求：
相对回收率 85％～115％（LOQ附近80％～120％）
RE ±15％（LOQ附近±20％）
三、准确度（accuracy）
指用该方法测得的生物样品中待测药 物浓度与其真实浓度的接近程度
通常使用模拟生物样品测定（空白 血浆＋浓度已知的对照品溶液），以测 得的浓度与添加浓度比较计算。
测定法：
取空白生物基质数份，在标准曲线范 围制备高（接近上限）、中、低（接近 LOQ）3个浓度，每一浓度至少5个样品， 与随行的标准曲线同法测定，以测得的浓 度与加入对照品溶液浓度比较计算。
筛选分离条件步骤：
1. 空白溶剂试验（方法特异性） 待测药物的非生物基质溶液（水溶液）
采用拟定方法进行预处理，并测定响应信 号。
考察目标：预处理（衍生化反应、萃取 分离）不干扰药物的测定。
2. 空白生物基质试验（方法的特异性） 取空白生物基质，如空白血浆，用拟
定的方法，照“空白溶剂试验”项下方法 操作。