不同膻味水平的龙陵黄山羊肝组织转录组SNP分析

马
琳，杨
明，王宣懿，等.不同膻味水平的龙陵黄山羊肝组织转录组SNP 分析［J ］.湖北农业科学，2022，61（4）：154-159．
收稿日期：2021-04-25
基金项目：云南省肉羊产业技术体系项目（2017KJTX0016）作者简介：马
琳（1995-），女，云南峨山人，在读硕士研究生，研究方向为动物遗传育种，（电话）184****9912（电子信箱）****************；
并列第一作者，杨
明（1994-），男，湖北荆州人，在读硕士研究生，研究方向为动物遗传育种，（电话）151****9591（电子信箱）
****************；通信作者，叶绍辉（1964-），男，云南昆明人，教授，硕士，从事动物遗传资源评价、保护与利用，（电话）180****1783（电子信箱）***************。

羊肉在世界各地广泛食用，但由于其膻味，在许多亚洲国家并不受欢迎。

4-甲基辛酸（4-Methyl oc⁃tanoic acid ，MOA ）、4-乙基辛酸（4-Ethyl octanoic ac⁃
id ，EOA ）和4-甲基壬酸（4-Methyl Nonanoic acid ，
MNA ）［1-3］
这3种化合物是引起羊肉膻味的主要物
质，此外还有3-甲基吲哚（3-Methyl indole ，MI ）和4-
不同膻味水平的龙陵黄山羊肝组织转录组SNP 分析
马
琳，杨
明，王宣懿，叶绍辉
（云南农业大学动物科学与技术学院，昆明
650201）
摘要：为加强山羊肉类的质量，探究膻味相关差异基因，对3个品种共14只羊的总膻味值进行显著性差异检验发现，高膻味水平（总膻味值大于771.845）和低膻味水平（总膻味值低于771.845）龙陵黄山羊总膻味值差异显著（P ＜0.05）。

通过对高膻味水平和低膻味水平的龙陵黄山羊肝组织进行转录组测序，将获得的数据进行SNP 检测，并利用GO 富集和KEGG 富集分析SNP 所在基因。

结果表明，高膻味水平的龙陵黄山羊特有的SNP 有411973个，低膻味水平的龙陵黄山羊特有的SNP 有444638个，2者共有SNP 856611个；GO 富集分析发现，SNP 所在基因大量富集在生物进程和细胞组成中；KEGG 富集分析发现，SNP 所在基因显著富集在磷脂酰肌醇信号系统、补体和凝血级联、胰岛素抵抗、拼接体、自噬-动物、辅因子的生物合成、内质网中的蛋白质加工、胞吞作用、AMPK 信号通路；对脂肪酸生物合成通路中的6个基
因SNP 分析发现，有7个SNP 位于同义编码区，其中有2个SNP 引起了氨基酸的改变。

关键词：龙陵黄山羊；肝脏；SNP ；GO 富集；KEGG 富集中图分类号：S826.8+9
文献标识码：A
文章编号：0439-8114（2022）04-0154-06
DOI:10.14088/ki.issn0439-8114.2022.04.031
开放科学（资源服务）标识码（OSID ）：
SNP analysis on liver transcriptome of Longling yellow goat with different odor levels
MA Lin ，YANG Ming ，WANG Xuan-yi ，YE Shao-hui
（College of Animal Science and Tecnology ，Yunnan Agricultural University ，Kunming 650201，China ）
Abstract ：In order to enhance the quality of goat meat and explore the difference genes related to the odor ，the total of 14sheep of three breeds were tested for the significance difference of the total odor value.It was found that there was significant difference （P <0.05）between Longling yellow goat with high （total odor value greater than 771.845）and low （total odor value less than 771.845）lev⁃els.Transcriptome sequencing of liver tissues of Longling yellow goats with high and low odor levels was carried out ，and SNP analysis was carried out on the obtained data ，and SNP genes were analyzed by GO enrichment and KEGG enrichment.The results showed that there were 411973SNPs peculiar to Longling yellow goats with high odor level and 444638SNPs peculiar to Longling yellow goats with low odor level ，and the common SNPs of two were 856611.GO enrichment analysis showed that SNP gene was enriched in biolog⁃ical process and cell composition.KEGG enrichment analysis showed that SNP gene was significantly enriched in phosphatidylinositol signaling system ，complement and coagulation cascade ，insulin resistance ，splice ，autophagy-animal ，cofactor biosynthesis ，protein processing in endoplasmic reticulum ，endocytosis and AMPK signaling pathway.Analysis of SNPs of six genes in fatty acid biosynthe⁃
sis pathway showed that seven SNPs were located in synonymous coding regions ，and two SNPs caused amino acid changes.Key words ：Longling yellow goat ；liver ；SNP ；GO enrichment ；KEGG enrichment
第4期
甲基苯酚（4-Methyl phenol，MP）［4，5］。

龙陵黄山羊（Longling yellow goat，LLG）是产于云南省保山市龙陵县及周边的地方品种，其具有体大、屠宰率高、耐粗饲等良种特性［6］。

但膻味却一直制约着龙陵黄山羊的发展。

羊的肝脏具有代谢功能，膻味物质的形成需要肝脏参与代谢，进而沉积到脂肪组织中，产生特有的羊膻味。

目前龙陵黄山羊的研究主要集中在肉品质、养殖方式、繁殖性能和疾病的研究，鲜见其膻味研究的相关报道。

单核苷酸多态性（Single nucleotide polymor⁃phisms，SNP），是指单个核苷酸的变异而导致的基因多态性，其数量很多，多态性丰富。

每个SNP位点都可以是4种不同的变异形式（转换、颠换、插入、缺失），其中转换和颠换二者之比为2∶1，可能是因为CpG二核苷酸中5-甲基胞嘧啶（5mC）脱氨基对胸腺嘧啶的高自发率而导致［7］。

SNP在CG序列上出现最为频繁，是因为CG中的C常被甲基化而转换成T。

SNP位点极其丰富，几乎遍及整个基因组。

虽然随着时空的改变转录基因种类可能会有些许变化，但转录组运用于检测转录区域多态性仍是1种高效且经济的方法［8］。

该研究旨在通过对龙陵黄山羊肝脏转录组SNP进行分析，探索龙陵黄山羊膻味相关差异基因，为龙陵黄山羊膻味的相关研究提供理论依据。

1材料与方法
1.1试验材料
选择饲养健康的龙陵黄山羊、云岭山羊（Yun⁃ling goat，YLG）和大理绵羊（Dali sheep，DLS）共14只；龙陵黄山羊取自云南省保山市龙陵县，云岭山羊和大理绵羊取自云南省大理市宾川县。

1.2样品采集
对试验山羊采用颈动脉放血处死，快速取其100~150g腰部皮下脂肪组织和肝脏组织，分别置于保鲜袋和无酶冻存管中，液氮条件下运回实验室，分别放入-20、-80℃冰箱保存待用。

所采集的皮下脂肪组织用于测定致膻物质（MOA、EOA、MNA、MI和MP）的含量。

所采集的肝脏组织用于转录组的测序，按提取要求取适量样本，采用Trizol法提取RNA，对提取的总RNA按一定比例进行稀释。

利用NanoPhotometer®分光光度计检测样品纯度（IM⁃PLEN公司），Qubit®3.0Flurometer（Life Technologies 公司）检测RNA样品浓度，安捷伦2100RNA Nano 6000AssayKit（Agilent Tech-nologies公司）检测RNA 样品的完整度和浓度。

1.3膻味值计算
通过气相色谱法测定致膻物质（MOA、MEA、EOA、MI、MP）5个指标的含量，然后将致膻物质的含量除以其膻味阈值得到膻味值，再将其膻味值进行加和得到总膻味值。

其中膻味阈值是指人们能够感知该化合物气味的最小浓度［9］，在pH=2的介质中MOA的膻味阈值是0.02μg/g，MNA的膻味阈值是0.65μg/g，EOA的膻味阈值是0.006μg/g［9，10］，MI的膻味阈值是0.303μg/g，MP的膻味阈值是0.7μg/g［11，12］。

对3个羊品种的膻味值进行显著性差异检验。

1.4高通量测序
根据膻味含量测定以及膻味值计算比较后，对挑选出的龙陵黄山羊（6只）的肝组织进行转录组测序。

总RNA样本检测合格后，选用带有Oligo（dT）的磁珠进行富集纯化mRNA，向纯化得到的mRNA 中加入Fragmentation Buffer使其片段成为短片段，以片段后的mRNA为模板，用六碱基随机引物合成cDNA第1链，并加入缓冲液、dNTPs、RNaseH和DNA PolymeraseⅠ合成cDNA第2链，经过QIA⁃Quick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱。

洗脱纯化后的双链cDNA再进行末端修复、加碱基A、加测序接头处理，然后经琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段并进行PCR扩增，从而完成整个文库制备工作。

质量合格的文库用Illumina平台进行测序，测序由北京擎科科技有限公司昆明分公司完成。

完成测序和质控的数据被用来与山羊参考基因组ARS1做比对，之后进行SNP检测以及GO、KEGG富集分析。

2结果与分析
2.1筛选转录组样本
以14个样本总膻味值的平均数（771.845）来分类，高于771.845膻味值的样本为高膻味水平组，低于771.845膻味值的样本为低膻味水平组，14个样本的膻味水平分组如表1所示。

对高膻味水平组和低膻味水平组进行差异检验发现（表2），云岭山羊和大理绵羊种内高低膻味水平组无显著差异（P>0.05），而龙陵黄山羊种内2个水平组差异极显著（P＜0.01），龙陵黄山羊种内高膻味水平和低膻味水平符合转录组样本的要求。

2.2转录组测序结果
对高膻味水平（LLG-H）和低膻味水平（LLG-L）的龙陵黄山羊肝脏组织共6个RNA样品进行测序，结果如表3所示，经过测序质量控制，共得到40.41Gb过滤后的数据，测序样本的总过滤序列数
马琳等：不同膻味水平的龙陵黄山羊肝组织转录组SNP分析155
湖北农业科学2022年
约为4490万，高质量序列数约为4132万，高质量序
列比率约为92.01%，各样品Q30比率均大于89.00%。

这表明测序数据质量良好，可用于后续分析。

表3龙陵黄山羊肝脏组织转录组测序结果
样本LLG-H-2 LLG-H-4 LLG-H-6 LLG-L-1 LLG-L-3 LLG-L-5均值总过滤序列数
47286754
42960696
45518076
42101270
45815662
45704548
44897834
高质量序列数
44272275
39320719
41363167
38321892
41975592
42677026
41321779
高质量序列
比率//%
93.63
91.53
90.87
91.02
91.62
93.38
92.01
Q30比率
//%
90.61
89.51
89.30
89.08
89.58
90.11
89.70
2.3SNP检测
2.3.1SNP统计利用samtools软件将经过排序、去PCR重复后的比对文件同参考序列进行比对，得到每个样品的SNP检测结果（表4）。

进一步分析发现，其中LLG-H特有的SNP（SNPLLG-H）有411973个，LLG-L特有的SNP（SNPLLG-L）有444638个，LLG-H和LLG-L共有SNP（SNPLLG）856611个。

根据变异的统计结果，对高膻味水平（LLG-H）和低膻味水平（LLG-L）龙陵黄山羊的SNP突变类型的分布进行统计（图1），结果显示6种单核苷酸变异中，C/T和A/G发生的频率最高。

表4肝脏转录组SNP检测结果
样品
SNP
InDel
总计
LLG-
H-2
117743
11070
128813
LLG-
H-4
106088
10357
116445
LLG-
H-6
188142
16820
204962
LLG-
L-1
88691
8703
97394
LLG-
L-3
240207
21116
261323
LLG-
L-5
115740
11038
126778 2.3.2SNP所在基因的注释利用Omicshare统计SNPLLG-H、SNPLLG-L和SNPLLG3组的SNP所在基因的GO富集情况，结果见图2，发现SNPLLG-H、SNPLLG-L和SNPLLG的SNP所在的基因参与生物进程、分子功能和细胞组成3个部分富集比例基本一致。

但是SNPLLG-H的SNP所在基因在每个功能的富集比例均大于SNPLLG-L所在基因。

利用Kobas对所有SNP所在基因进行KEGG富集分析，发现总共有4073个基因注释到339个通路上。

SNP所在基因显著富集在磷脂酰肌醇信号系统、补体和凝血级联、胰岛素抵抗、拼接体、自噬-动物、辅因子的生物合成、内质网中的蛋白质加工、胞吞作用、AMPK信号等通路（图3）。

2.4脂肪酸生物合成通路中SNP功能的生物信息学分析
脂肪酸生物合成是膻味的关键来源，动物脂肪细胞中脂肪的合成直接影响脂肪酸的含量，羊肉膻味相关的脂肪酸正是在各种酶的参与调控下发挥作用。

乙酸是脂肪酸合成的主要前体物质，在反刍动物瘤胃发酵下可以产生乙酸。

在脂肪细胞内，乙酸在酶的作用下合成乙酰辅酶A，然后在乙酰辅酶A 羧化酶的催化下形成丙二酸单酰辅酶A，随后由还原型烟酰氨腺嘌呤二核苷酸磷酸生成酶提供还原氢，脂肪酸合成酶（FASN）催化合成长链脂肪酸，之后细胞利用脂蛋白脂酶水解产生的脂肪酸和细胞从头合成的脂肪酸酯化形成甘油三酯，而激素敏感酯酶则催化甘油三酯水解为甘油和游离脂肪酸（短链脂肪酸）［13］。

膻味就是由于其产生的短链脂肪酸而产生的。

根据KEGG富集结果，发现共有19个含SNP的基因富集到脂肪酸生物合成通路，从其中随机挑选6个有SNP的基因进行生物信息学分析，结果见表
表1所有样本膻味水平分组
样本DLS-1 DLS-2 DLS-4 DLS-5 YLG-3 YLG-6 YLG-7 YLG-8 LLG-1 LLG-2 LLG-3 LLG-4 LLG-5 LLG-6总膻味值
918.625
653.991
889.213
734.914
916.85
799.119
825.337
717.697
571.797
944.939
607.154
866.417
585.682
774.091
高膻味
样本
DLS-1
DLS-4
YLG-3
YLG-6
YLG-7
LLG-2
LLG-4
LLG-6
高膻味
水平组
DLS-H
YLG-H
LLG-H
低膻味样
本
DLS-2
DLS-5
YLG-8
LLG-1
LLG-3
LLG-5
低膻味
水平组
DLS-L
无
LLG-L
表2高膻味水平与低膻味水平样本的差异检验
分组DLS-H VS YLG-H DLS-H VS LLG-H DLS-H VS LLG-L DLS-L VS YLG-H DLS-L VS LLG-H DLS-L VS LLG-L YLG-H VS LLG-H YLG-H VS LLG-L LLG-H VS LLG-L
P 0.3163 0.5615 0.0004** 0.0714 0.0982 0.0484* 0.8210 0.0022** 0.0056**
注：“*”“**”分别表示差异显著（P<0.05）和差异极显著（P<0.01）156
第4期5。

由表5可知，6个基因中共有7个SNP 位于同义
编码（SYNONYMOUS_CODING ）区域，利用Editseq 将含有SNP 的SYNONYMOUS_CODING 区域序列翻译为氨基酸，与原氨基酸序列进行比对，发现2个SNP 引起了氨基酸的改变，FASN 、ACACA 基因为沉默突变，ACSL3基因为沉默突变、无义突变和错义突变，其中ACSL3基因上的SNP 在高膻味水平和低膻味水平的龙陵黄山羊都有表现，ACSL6基因上的SNP 是低膻味水平龙陵黄山羊特有，但是其氨基酸没有改变，FASN 、ACACA 基因上的SNP 为高膻味水
平龙陵黄山羊所特有。

3小结与讨论
转录组测序广泛应用于定量基因表达和非注释
转录本的鉴定，作为生物学信息的来源，可用于鉴定导致复杂性状变异的原因［14］。

除此之外，也有研究表明利用转录组测序进行SNP 的筛选是可行的［15］。

使用转录组测序技术大大降低了试验成本，并且获得的数据反映了基因表达，这是最基本的分子表型。

转录组测序还能够在特定基因座处提供较高的深
度，能够发现高表达基因中的偶发等位基因［16，17］。

该研究发现，6种单核苷酸变异中，以C/T 和
2000015000100005000
N u m b e r
A →G
G →A C →T T →C A →C C →A A →T T →A C →G G →C G →T T →G LLG-H-2
2000015000100005000
N u m b e r
A →G G →A C →T T →C A →C C →A A →T T →A C →G G →C G →T T →G
LLG-H-4
300002000010000
N u m b e r
A →G G →A C →T T →C A →C C →A A →T T →A C →G G →C G →T T →G
LLG-H-6
15000100005000
N u m b e r
A →G G →A C →T T →C A →C C →A A →T T →A C →G G →C G →T T →G
LLG-L-140000300002000010000
N u m b e r
A →G G →A C →T T →C A →C C →A A →T T →A C →G G →C G →T T →G
LLG-L-3
2000015000100005000
A →G
G →A C →T T →C A →C C →A A →T T →A C →G G →C G →T T →G
LLG-L-3
N u m b e r
图1
SNP 突变类型
5000450040003500300025002000150010005000
基因数目//个
SNPLLG-H SNPLLG-L SNPLLG
图2SNP 所在基因的GO 分析
马琳等：不同膻味水平的龙陵黄山羊肝组织转录组SNP 分析
157
湖北农业科学2022年
A/G发生频率最高，这与转换突变发生频率高于颠换的结果相符合。

通过对SNPLLG-H、SNPLLG-L、SNPLLG的SNP所在基因进行GO富集，发现SN⁃PLLG-H的SNP所在基因在每个功能的富集比例均大于SNPLLG-L的SNP所在基因。

SNPLLG-H的SNP所在基因显著富集在核体、细胞器内膜、细胞-基底粘附体结、细胞质、胞内膜-有界细胞器、细胞外空间、嘌呤核糖核苷结合、过渡金属离子结合、核糖核酸结合、泛素样蛋白连接酶结合、磷酸酶结合、谷胱甘肽过氧化物酶活性的调节、囊泡介导的转运、脂肪酸代谢过程、内皮细胞迁移的调节、胆固醇代谢过程等类别，SNPLLG-L的SNP所在基因显著富集在胞内膜-有界细胞器、细胞外区域、核腔、细胞质、细胞-基底粘附体结、细胞外空间、膜、核糖核酸结合、蛋白结合、阳离子结合、过渡金属离子结合、嘌呤核糖核苷结合、激酶结合、泛素样蛋白连接酶结合、泛素样蛋白转移酶活性、磷酸酶结合、谷胱甘肽过氧化物酶活性的调节、修饰依赖性蛋白质分解代谢过
0.020.030.040.05
GeneRatio Count 100 150 200 qvalue 4.0e-06 8.0e-06 1.2e-05 1.6e-05
注：图中每1个圆表示1个KEGG通路，纵坐标表示通路名称，横坐标为基因比率，表示差异基因中注释到某通路的基因比例。

富集因子越大，表示差异表达基因在该通路中的富集水平越显著。

圆圈的颜色代表qvalue，qvalue为多重假设检验校正之后的pvalue，qvalue越小，表示差异表达基因在该通路中的富集显著性越可靠；圆圈的大小表示通路中富集的基因数目，圆圈越大，表示基因越多
图3SNP所在基因的KEGG分析
表5脂肪酸生物合成通路SNP功能的生物信息学分析
样本LLG-L LLG-L LLG-H LLG-H LLG-L LLG-H LLG-H LLG-H LLG-H LLG-H LLG-L LLG-H LLG-H LLG-H LLG-H LLG-H 染色体编号
NC_030814.1
NC_030814.1
NC_030826.1
NC_030815.1
NC_030815.1
NC_030809.1
NC_030809.1
NC_030809.1
NC_030809.1
NC_030809.1
NC_030809.1
NC_030829.1
NC_030829.1
NC_030829.1
NC_030826.1
NC_030826.1
SNP位置
88024705
88024722
50169342
968138
966145
24706266
24715963
24717324
24720209
24721511
24731547
42947233
42947904
42951774
13065718
13126100
基因名
ACSL6
ACSL6
FASN
CBR4
CBR4
ACSL3
ACSL3
ACSL3
ACSL3
ACSL3
ACSL3
RPP14
RPP14
RPP14
ACACA
ACACA
SNP变异
C/T
G/A
G/A
G/A
G/A
G/A
G/A
G/A
C/T
C/T
G/A
T/A
T/C
C/A
G/A
G/A
SNP在基因上的位置
3’UTR
3’UTR
SYNONYMOUS_CODING
3’UTR
3’UTR
SYNONYMOUS_CODING
SYNONYMOUS_CODING
NON_SYNONYMOUS_CODING
SYNONYMOUS_CODING
SYNONYMOUS_CODING
NON_SYNONYMOUS_CODING
3’UTR
3’UTR
3’UTR
SYNONYMOUS_CODING
SYNONYMOUS_CODING
密码子改变
·
·
CCG/CCA
·
·
GAG/GAA
UAG/UAA
GAG/AAG
GAC/GAU
GGC/GGU
AUG/AUA
·
·
·
GGG/GGA
GAG/GAA
氨基酸改变
·
·
·
·
·
·
·
E/K
·
·
M/I
·
·
·
·
·
注：“·”表示密码子或氨基酸没有改变158
第4期
程、活性氧代谢过程、内胚层形成、细胞连接组件等
类别。

两组SNP（SNPLLG）所在基因富集在不同的
生物功能，可能与龙陵黄山羊的膻味有关，龙陵黄山
羊支链脂肪酸的产生导致羊膻味的发生。

而膻味相
关基因究竟是如何影响其膻味的，还需要进一步研
究。

研究表明，ACACA、FASN是脂肪酸从头合成的
关键限速酶，在细胞之类代谢过程以及脂肪酸生物
合成中起重要调控作用，FASN表达模式虽有差异但
其表达水平与脂肪含量都显著正相关［18］，其表达受
到多种激素的调控，当其表达上调时，能增加膻味的
产生［19］。

ACSL基因家族成员中不同成员在不同组
织中有着不同的作用和表达，暗示了每种ACSL成员
可能在特定的组织中发挥着不同的特定作用，AC⁃
SL6往往会促进长链多不饱和脂肪酸的产生［20］，而
支链脂肪酸是膻味的来源，ACSL6可能会抑制短链
脂肪酸的生成，因此可能会降低羊的膻味［21］。

该研
究通过对SNP所在基因KEGG富集发现，SNP所在
基因显著富集在在磷脂酰肌醇信号系统、补体和凝
血级联、胰岛素抵抗、拼接体、自噬-动物、辅因子的
生物合成、内质网中的蛋白质加工、胞吞作用、AMPK信号等通路。

从与膻味相关的脂肪酸生物合成通路中随机挑选出6个含SNP的基因，发现6个基
因中，有2个基因的SNP导致了氨基酸的改变，其中
ACSL3基因上的SNP在高膻味水平和低膻味水平的
龙陵黄山羊都有表现，ACSL6基因上的SNP存在于
低膻味水平的龙陵黄山羊，而FASN、ACACA基因上
的SNP为高膻味水平龙陵黄山羊特有。

因此，AC⁃
SL6基因的变异可能会降低龙陵黄山羊的膻味，而
FASN、ACACA基因的变异可能与龙陵黄山羊的高膻
味有关。

参考文献：
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