低浓度紫杉醇与替莫唑胺作用胶质瘤U87的机制

低浓度紫杉醇与替莫唑胺作用胶质瘤U87的机制
梁会娟;梁海乾;魏向阳;周欣;张赛
【摘要】目的:探讨紫杉醇(PTX)、替莫唑胺(TMZ)对神经胶质瘤U87细胞的细胞周期阻滞的影响和可能机制.方法:将U87细胞分4组接种于细胞培养皿中,每孔接种103个,每组6孔,用CCK-8法绘制紫杉醇、替莫唑胺及两者不同浓度联合作用的增殖抑制曲线,测定增殖抑制率,光镜下观察增殖抑制周期.结果:PTX联合TMZ可以明显抑制U87细胞的增殖,抑制作用呈时间依赖性,较低浓度作用显著,光镜下显示细胞周期阻滞于纺锤体期.结论:PTX联合TMZ可以抑制神经胶质瘤U87细胞增殖,细胞周期阻滞于M期,从而诱导凋亡.
【期刊名称】《安徽卫生职业技术学院学报》
【年(卷),期】2018(017)006
【总页数】2页(P107-108)
【关键词】紫杉醇;替莫唑胺;神经胶质瘤细胞;细胞周期
【作者】梁会娟;梁海乾;魏向阳;周欣;张赛
【作者单位】沈阳积水潭医院辽宁沈阳 110020;武警部队脑创伤与神经疾病研究所武警后勤学院附属医院天津 300162;武警部队脑创伤与神经疾病研究所武警后勤学院附属医院天津 300162;武警部队脑创伤与神经疾病研究所武警后勤学院附属医院天津 300162;武警部队脑创伤与神经疾病研究所武警后勤学院附属医院天津 300162
【正文语种】中文
【中图分类】R739.41
胶质瘤属于神经系统的一种恶性肿瘤，其发病率最高，据相关调查报道显示：颅内恶性肿瘤的发病率为每年每10万人中有6.8人，而其中胶质瘤就占到80%[1]。

目前普遍采用手术切除并辅以术后放、化疗治疗胶质瘤，化疗在诸多治疗环节中至关重要，其成败对病人的生活质量和预后影响很大。

随着应用时间的延长，替莫唑胺、紫杉醇，疗效下降与耐药趋势越来越明显，且耐药均与P53相关，两者联合，能否起到起到协同作用。

现将研究结果报道如下：
1 材料与方法
1.1 材料胶质瘤细胞U87（武警后勤学院附属医院脑研所），PTX、TMZ（由美
国Sigma公司提供），胎牛血清（由美国Hyclone公司提供），DMEM培养基（由美国Gibco公司）提供，CCK-8试剂盒（由武汉博士德公司提供）。

1.2 细胞培养将U87胶质瘤细胞置入10%胎牛血清HDMEM中进行培养，放入37 ℃培养箱内，5%CO2，并用0.25%胰蛋白酶消化传代，每3天1次。

1.3 TMZ、PTX半数抑菌浓度（IC50）确定①对数生长期U87细胞，按1×103/孔接种于96孔培养板，24 h。

②加入浓度PTX（0.5、0．03125 ng/mL）或TMZ（5、0.3125 µg/mL）或两者混合液干预细胞24 h、48 h、72 h后，设5
个复孔，加入每孔CCK-8溶液（5 mg/mL）10µL，终体积100 µL，孵育1 h，
采用全自动酶标仪，波长450nm下测定光密度（OD）值，生长抑制率（%）=（OD对照－OD药物）/（OD对照－OD空白）×100%。

1.4 统计学方法采用SPSS 11.0统计软件处理数据。

计量资料采用（）表示，采
用配对t检验比较（双侧），P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 PTX、TMZ、PTX+TMZ细胞生长抑制率的比较[1] PTX、TMZ的IC50分别
为0.5 ng /mL和5 µg/mL，PTX+TMZ与TMZ、PTX单独作用于U87的结果比较：0.03125 ng/mL PTX与0.3125 ng/mL TMZ两个浓度联合，在24 h与48 h呈现拮抗作用，差异有统计学意义（P均＜0.01）；72 h两者联合呈现协同作用，差异具有统计学意义（P均＜0.01）；5 ng/mL PTX与0.5 ug/mL TMZ两个浓度联合，与二者单独作用比较，24 h、48 h内呈拮抗作用（P均＜0.01）。

作用72 h与两者单独作用比较，差别没有统计学意义。

见表1。

表1 PTX、TMZ、PTX+TMZ细胞生长抑制率注：0．03125 ng/mL PTX与0．3125 ng/mL TMZ两个浓度联合，差异具有统计学意义（⋆P＜0．01，#P＜0．01），▲P＜0．01，※P＜0．01）；5 ng/mLPTX与0．5 ug/mL TMZ两个浓度联合，与两者单独作用比较，差异有统计学意义（#P均＜0．01）。

药物名称生长抑制率24 h 48 h 72 h PTX(0．5ng/mL) 0．83±0．04 0．78±0．01 0．67±0．04 TMZ(5ug/mL) 0．50±0．010．87±0．04 0．72±0．01
PTX+TMZ(0．03125+0．3125)0．42±0．01#0．15±0．01#2．35±0．03 ▲ ※PTX+TMZ(5 ng/mL+0．5g/mL)0．26±0．01 0．21±0．01 0．76±0．02 2.2 光镜下的联合作用图片[2] 72 h后，镜下可见大量的巨核细胞，纺锤体形成，细胞周期阻滞于M期，有丝分裂停止。

见图1b。

注：图1a：200倍光镜下U87细胞干预前图片；图1b干预后
（0．03125+0．3125 PTX+TMZ联合作用72 h后）的图片。

3 讨论
胶质瘤属于中枢神经系统的一种比较常见的恶性肿瘤，在侵袭过程中犹如树根一样生长和扩张。

尽管现阶段对于胶质瘤治疗可采用免疫学方法先进性标记，然后使用免疫显微镜将病变组织尽可能地切除，但是由于患者的颅内解剖以及功能定位的复杂性，使得完全切除存在非常大的困难，患者在手术后实施放化疗辅助治疗也仍然无法完全遏止恶性胶质瘤的发展，预后往往不乐观。

根据世界卫生组织的统计调查
显示，胶质瘤Ⅲ级患者的生存期通常只有2～3年，而Ⅳ级患者生存期仅仅只有1
年左右，如胶质母细胞瘤患者[3]。

从表1我们看到，48 h内呈现拮抗作用，72 h后表现为协同作用，且在1/6治疗剂量下，两者协同作用发挥到了最大。

光镜下（图1）见两者联合作用有丝分裂相停滞于M期，大量纺锤体形成，细胞呈巨核细胞表现。

分析紫杉醇是一种水溶性
分子，作用于微管网，与N端31位和217-231位氨基酸结合，诱导和稳定微管
蛋白，细胞周期阻滞于G2/M期。

尽管无法对DNA直接起作用，但是其可以对Raf-1的级联反应产生诱导，并进一步诱导P53表达，导致Raf-1/Bcl-2磷酸化，抑制Bcl-2，从而引起了P53表达的上调。

研究表明，紫杉醇耐药性与P53的表
达相关，Li G等[4]研究中利用P53突变或者沉默构建小鼠模型，通过实验显示，
8 mg/kg的紫杉醇和剂量为2Gy的放疗在移植了非小细胞肺癌的小鼠模型中具有明显的抑制作用[5]。

替莫唑胺属于烷化剂，在人体当中通过非酶解途径可以促进DNA的甲基化作用，甲基化产物包括了N3、N7位的甲基化与O6-甲基鸟嘌呤（O6-mG）的甲基化。

国外有研究报道了分别使用不同剂量替莫唑胺（25 ummol/L和50 ummol/L）作用于MGMT甲基化与O6-甲基鸟嘌呤DNA-甲基
转移酶（MGMT）的剔除模型，结果显示替莫唑胺耐药性和MGMT具有显著的
剂量相关性，同时和P53的表达相关。

两者共同对P53产生作用，对核糖核苷酸还原酶基因的表达具有上调作用，同时保证DNA的稳定[6]。

Gori JL等[7]人以基因修饰后高表达MGMT的狗模型为实验对象，对其采用替莫唑胺和卡氮芥治疗，当两者的活性分别为550～850 mg/m2和150 mg/m2时与离体时剂量的5倍
相当。

国内学者丁照义及其导师带领的课题组，以胶质瘤大鼠为实验对象，开展了体外培养大鼠胶质瘤C6细胞实验，通过研究结果显示，给予大鼠紫杉醇、替莫唑胺后，大鼠的胶质瘤细胞生长收到明显的抑制，并且细胞出现凋亡，并且通过验证发现，二者联用的效果比单独用药效果更为理想，由此指出，这种作用效果是与
Caspse-3 mRNA表达上调有关[6]。

总之，紫杉醇与替莫唑胺联合，可以发挥明显的协同作用，随着作用时间的延长，细胞内的修复系统功能耗竭，损伤瀑布启动，酸中毒、缺氧、营养不良的微环境逐步恶化，遗传物质、新陈代谢及能量转化等都发生了抑制崩溃，导致肿瘤细胞死亡。

参考文献
【相关文献】
[1] 梁会娟.紫杉醇增强替莫唑胺对胶质瘤U87细胞的敏感性[D].天津医科大学硕士论文，2015.
[2] 梁会娟，梁海乾，涂悦，等.替莫唑胺、紫杉醇对神经胶质瘤U87细胞增殖的联合作用效果观
察[J].山东医药杂志，2013(1):35～38.
[3] Blough， M.D. Effect of aberrant p53 function on temozolomide sensitivity of glioma cell lines and brain tumor initiating cells from glioblastoma. J Neurooncol，2011，102(1): 1～7.
[4] Li G， Zhao J， Peng X， et al. Radiation/paclitaxel treatment of p53-abnormal non-small cell lung Cancer xenograft tumor and associated mechanism[J].Cancer Biother Radiopharm， 2012， 27(4): 227～233.
[5] Sato A， Sunayama J， Matsuda K， et al. MEKERK signaling dictates DNA-repair gene MGMT expression and temozolomide resistance of stem-like glioblastoma cells via the MDM2-p53 axis[J]. Stem Cells， 2011， 29(12): 1942～1951.
[6] 王占峰，韩海玲，房向阳，等.键合紫杉醇纳米胶束增强替莫唑胺抑制胶质瘤细胞的实验研究[J].中国实验医学，2013，1(17):1～4.
[7] Gori JL， Beard BC， Ironside C， et al. In vivo selection of autologous MGMT gene-modified cells following reduced-intensity conditioning with BCNU and temozolomide in the dog model[J]. Cancer Gene Ther， 2012， 19(8): 523～552.。