重组质粒的酶切鉴定及PCR实验1

重组质粒的酶切鉴定及PCR实验
崔文强201300140012生态
同组者：陈斌郝书平
摘要 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是1986年由Kallis Mullis 发现。

这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析等方面。

本次实验旨在通过学习和掌握酶切和PCR反应的基本原理和实验技术，以验证重组质粒插入片段大小。

关键词酶切；重组质粒；插入片段；PCR
1.引言
将含有外源DNA的转化子的E.coliDH5α菌株进行培养，并用试剂盒提取其质粒DNA，将所提取的DNA用切pUC19质粒的同一种限制性内切酶进行切割以验证所插入的外源DNA 的大小，这就是重组质粒酶切鉴定。

接着进行PCR检验，PCR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物，经酶促合成特异的DNA 片段的体外方法。

反应过程由高温变性，低温退火和延伸等几步反应组成一个循环，然后反复进行，使目的的DNA 得以迅速扩增。

置待扩增DNA 于高温下解链成为单链DNA 模板，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合，DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物3'端开始掺入，沿模板5'—3'方向延伸，合成DNA 新链。

由于每一循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR 产物以指数方式增加，经25—30次周期之后，理论上可增加109倍，实际上可增加107倍。

PCR 技术具有操作简便、省时、灵敏度高特异性强和对原始材料质量要求低等优点，但由于所用的TaqDNA 聚合酶缺乏5'—3'核酶外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入，估计每9000个核苷酸会导致一个掺入错误，但是错误掺入的碱基有终止链延伸的作用倾向，使得错误不会扩大。

2.实验材料和方法
2.1实验材料
PRC扩增仪，琼脂糖凝胶电泳设备，移液器，0.2ml薄壁PCR管，凝胶成像仪，模板pUC19重组质粒，寡核苷酸引物（上游引物M13F，下游引物M13R），TaqDNA聚合酶（TaKaRa，-20℃贮存），dNTPs（TaKaRa，-20℃贮存），10×PCR反应缓冲液（TaKaRa，-20℃贮存）
高速离心机，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，量筒，移液枪，冰盒，枪尖，Eppendorf管，微量移液器，手套，记号笔，TAE电泳缓冲液(10×)，琼脂糖，溴化乙锭(EB)，DNA相对分子质量标准物DNA Marker k／Hin dⅢ，DL5000。

2.2实验方法
2.2.1重组质粒的酶切、电泳检测
对于电泳显示插入片段在2.0kb以上的重组质粒，采用HindⅢ酶切进行验证。

大片段或高产量的重组质粒推荐的反应体系（10μl体系）如下：
表1质粒酶切反应体系
轻弹混匀后，短暂离心，于37℃孵育1.5hr后，保存于 -20℃，备电泳检测。

取酶切产物10 ul，加入2 ul 10×loading buffer，混匀后点样。

取重组质粒2 ul，加入4μL dd H2O，1 ul 10×loading buffer，混匀后点样。

以λ DNA/HindIII为Marker，点样顺序如表2。

100V恒压电泳约40min。

电泳结束EB 染色10min，水洗后紫外灯下观察实验结果。

表2重组质粒酶切上样顺序
2.2.2重组质粒的PCR验证
对于电泳显示插入片段在2.0kb以下的重组质粒，采用PCR进行验证。

引物此次重组用到的载体是pUC19，限制性内切酶为Hind Ⅲ，所以选择Hind Ⅲ酶切位点两侧一定距离的序列制作引物。

由于载体pUC19上两引物间序列的长度是150bp，所以PCR扩增产物的长度（bp）=150+插入片段的长度。

实验中首先建立反应体系：
表3 PCR 引物
表4 PCR 反应体系
建立体系后将加好样的PCR 管进行标记，放入PCR 仪中，设定反应基本参数如表5所示
表5 PCR 反应程序
（1） 预变性：让DNA 双链充分解离,然后第一次退火过程时候引物可以尽量多的结
合到模版上面这主要是为了保险起见，使模板DNA 的二级结构充分打开。

（2） 变性：通过加热使DNA 双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA 。

（3） 复性：当温度突然降低时由于模板分子结构较引物要复杂的多，而且反应体系
中引物DNA 量大大多于模板DNA ，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA 双链之间互补的机会较少。

（4） 延伸：在DNA 聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸底物及镁离子存在的条件下 ，
5＇-→3＇的聚合酶催化以引物为起始点的DNA 链延伸反应。

（5） 终延伸：循环完成后 使PCR 反应完全以提高扩增产量，在用普通Taq 酶进行
PCR 扩增时在产物末端加A 尾的作用，可以直接用于TA 克隆的进行。

PCR 结束之后对产物进行电泳检测，用1%的琼脂糖凝胶电泳：20ulPCR 产物中加3.0ul 10×loading buffer ，混合均匀，取5ul 点样，上样顺序如表6。

以DL2000和DL5000为Marker 。

100V 恒压电泳约40min 。

电泳结束EB 染色10min ，水洗后紫外灯下观察实验结果。

表6 PCR产物上样顺序
泳道 1 2 3 …8 9 10 11
样品DL2000 1-1 1-2 4-1 4-2 DL5000 DL2000 样量μL 5 10 10 10 10 5 5
作用Marker Marker Marker 3.实验结果和分析
3.1实验结果
3.1.1重组质粒的酶切电泳结果
将重组质粒酶切之后进行琼脂糖凝胶电泳，成像如图1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
图1重组质粒酶切凝胶电泳成像图
第3、4泳道是我们组的结果，分别是重组质粒和酶切后的重组质粒，因为插入片段很小，所以酶切是借用的2组的质粒。

由泳道3可以看出重组质粒大小与λDNA/HindⅢ中4361的条带大致平齐，推测其大小为4300，泳道4中自上而下一共五条带，最上面的条带
，第2条带是切开的pUC19载体，下面三条分别是酶切开的大小为2027、564和125bp的片段。

3.1.2重组质粒的PCR验证结果
1.琼脂糖电泳展示的克隆片段的PCR扩增结果如下图：
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
图2 重组质粒的PCR验证结果
我们组的结果是第2、3泳道，与DL2000marker对比来看，大小比250bp的条带稍大，减去两引物间序列的长度150bp，可以得出插入片段的大小是125bp。

4.讨论
4.1注意事项
（1）限制性内切酶的酶切反应属于微量操作技术，无论是DNA样品还是酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性并确保样品和酶全部加入反应体系；
（2）酶切反应的所有塑料制品（Eppendorf管、吸头等）必须是新的，并经过高温灭菌，操作时打开使用，操作过程不要求无菌，但要注意手和空气中杂酶的污染，因此要求环境干净，戴手套操作，尽量减少走动，缩短Eppendorf管的开盖时间。

（3）注意酶切加样的顺序，一般先加重蒸水，其次加缓冲液和DNA，最后加酶。

前几步要把样品加到管底的侧壁上，加完后用力将其甩到管底，而酶液要在加入前从-20℃冰箱取出，酶管放置在冰上，取酶液时洗头应从表面吸取，防止由于插入过深而使吸头外壁沾染过多的酶液，取出的酶液应立即加入反应混合也得液面以下，并充分混匀。

酶液使用完毕后立即放回冰箱，防止酶的失活。

（4）Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)，复性温度=Tm值-(5～10℃)，本实验两个引物的Tm分别为64.7℃，57.9℃，选用退火温度为58℃，这是因为在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。

4.2 PCR反应的要素
PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即：引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。

（1）PCR引物设计
PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。

设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

引物设计的基本原则
①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。

②引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。

ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。

③引物内部不应出现互补序列。

④两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。

⑤引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。

⑥引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G 和C。

⑦引物的5 ′端可以修饰。

如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

（2）模板的制备
聚合酶链锁反应PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。

模板的取材主要依据PCR的扩增对象，标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。

多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。

难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。

所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。

（3）反应的控制
①PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子
②镁离子浓度总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5mmol/L
③底物浓度 dNTP以等摩尔浓度配制，20～200umol/L
④TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul）
⑤引物浓度一般为0.1 ～ 0.5umol/L
⑥反应温度和循环次数
变性温度和时间 95℃，30s
退火温度和时间低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃
延伸温度和时间 72℃，1min/kb(10kb内）
Tm值=4(G+C) +2(A+T)
循环次数：一般为25 ～ 30次。

循环数决定PCR扩增的产量。

模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的扩增量。

但循环数并不是可以无限增加的。

一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。

（4）扩增产物电泳条带分析
在琼脂糖展示扩增产物时往往会出现4种干扰现象，即假阴性——不出现扩增条带；假阳性——出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高；非特异性扩增带；片状拖带。

假阴性和假阳性
导致实验结果出现假阴性和假阳性的原因很多，如引物设计是否合理，两条引物的浓度是否对称，模板核酸的制备，酶的质量，PCR循环条件等，应根据实验设计和操作记录具体分析，再通过重复实验进行验证。

非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

非特异性条带的出现，可能是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体或退火温度过低、PCR循环次数过多引起的。

可以设计阴性对照实验与实验组的结果进行对比，以消除影响。

片状拖带
在本次PCR扩增电泳结果中出现轻微涂抹带的现象，其原因应该是与上样量过多有关。

其对策有减少dNTP的浓度，减少循环次数或是通过计算减少上样量。

参考文献
1.汪天虹分子生物学实验
2.郑景生吕蓓 PCR 技术及实用方法分子植物育种, 2003 年, 第 1卷, 第 3 期, 第381—394页
3.。