猪肉解冻过程中损伤型气单胞菌检测方法的优化

猪肉解冻过程中损伤型气单胞菌检测方法的优化
董庆利;梁娜
【摘要】为优化解冻猪肉中损伤型气单胞菌的检测方法,取-18℃冷冻48 h的猪肉解冻后分别应用含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSAYE）、营养琼脂（NA）和气单胞菌选择性琼脂（ASA）比较损伤性气单胞菌修复效果,进而对优选的培养
基分别添加2%和4%的NaCl,探讨气单胞菌的耐盐度。

通过向气单胞菌的选择性
培养基中分别添加1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%的NaCl,经差异显著性分析得出合适的气单胞菌损伤培养基,最后以损伤培养基总菌数与选择性培养基之比作
为修复率来比较磷酸缓冲液（PBS）、缓冲蛋白胨水（BP）和营养肉汤（NB）三
种不同修复介质的差异。

结果表明,TSAYE优于NA和ASA用于损伤性气单胞菌的修复,TSAYE＋1.5%NaCl为合适的损伤培养基,损伤型气单胞菌的数量可以添加
1.5%NaCl前后的菌落数之差来计数。

同时,25℃下TSAYE＋NB修复介质为损伤
型气单胞菌的适宜修复条件,修复时间为1 h。

%In order to optimize the method for detection of injured Aeromonas spp.,thawed pork inoculated with Aeromonas spp.after frozen for 48 h under-18℃ was detected using Tryptic Soy Agar with 0.6% Yeast Extract(TSAYE),Nutrient Agar(NA) and Aeromonas Selective Agar(ASA),respectively.Then the selected medium was supplemented with 2% and 4% NaCl respectively for the study of salt-tolerance of Aeromonas spp.Furthermore,the medium was supplemented with 1.0%,1.5%,2.0%,2.5% and 3.0% NaCl,respectively,for selecting the proper injured Aeromonas spp.culture based on the analysis of variance.Moreover,the optimized comparison of repair substrate was conducted on the ratio of injuring and selecting medium counting,which
based on the Phosphate Buffer System(PBS),Buffer Peptone water(BP) and Nutrient Broth(NB),respectively.Results showed that TSAYE was more appropriate than NA and ASA for the repair medium of Aeromonas spp.,and TSAYE with 1.5% NaCl could be used for counting injured Aeromonas spp.for the following studies.The number of injured Aeromonas spp.colonies was counted by difference between the numbers of colonies using TSAYE medium with and without 1.5% NaCl.The optimization results indicated that the proper repair temperature and culture medium for injured Aeromonas spp.was 25℃ and NB in liquid culture,respectively,and the repair time might be 1 h for this bacteria.
【期刊名称】《食品与发酵工业》
【年(卷),期】2012(038)006
【总页数】4页(P186-189)
【关键词】解冻猪肉;损伤型气单胞菌;培养基;优化
【作者】董庆利;梁娜
【作者单位】上海理工大学医疗器械与食品学院,上海200093;上海理工大学医疗器械与食品学院,上海200093
【正文语种】中文
【中图分类】TS251.1
冷冻肉作为肉类储备和企业加工的原材料可以在低温状态下储存较长时间，在肉的流通过程中起着重要作用。

冷冻肉解冻后的安全以微生物影响最为显著。

肉类经过
相关处理(包括冷冻处理)后，一部分微生物会死亡，一部分可能存活，另一部分可能会亚损伤。

亚损伤微生物是在适宜的条件下(如解冻)可以恢复到正常状态的微生物［1］。

微生物中的不良环境下如食品加工、贮藏、冷冻、干燥和辐射等作用可引起亚损伤［2］。

损伤微生物可在合适的条件下进行自我修复，从而对食品安全产生潜在威胁。

由于不良环境破坏了细菌的渗透屏障，导致细菌对选择性物质敏感，失去在正常生存环境条件下的生长繁殖能力。

可以普通培养基与选择性损伤培养基上菌落数的差值作为损伤菌数［3］。

有报道研究李斯特菌［4］、金黄色葡萄菌［5］、沙门氏菌［6］的热损伤及大肠杆菌［7］、乳酸菌［8］的冷冻损伤，但冷冻损伤型气单胞菌的检测研究尚未见报道。

本研究以解冻猪肉中的优势腐败菌之一的气单胞菌为研究对象，在猪肉冷冻过程中会造成亚致死性损伤，通过对修复培养基及损伤培养基进行优化，找出合适的损伤型气单胞菌检测方法，完善气单胞菌检测理论体系，为肉制品的安全提供保障。

1.1 冷冻猪肉原料及菌种接种
屠宰24h的优质猪精腿肉，购于上海卜蜂莲花超市，迅速分装置于－18℃冰箱中备用。

气单胞菌(No．23564)，中国工业微生物菌种保藏管理中心。

取气单胞菌菌株进行平板划线，然后于气单胞菌液体培养基中培养12 h，27℃下活化3次，制得菌种原液浓度达到108CFU/mL。

应用无菌生理盐水(0.85%NaCl溶液)稀释菌种原液制得菌悬液，称取25 g大小相近的肉样悬浮于80℃无菌水中10 s进行灭菌。

应用浸泡法进行肉样接种，即将灭菌后肉样浸入菌悬液中15 s接种。

接种后将肉样封装于无菌袋中，测定起始接种量，放入－18℃冰箱并计时。

1.2 培养基与试剂
培养基的配制参照文献［9］，包括含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂(TSAYE)、气单胞菌选择性琼脂(ASA)和营养琼脂(NA)。

各种试剂配方参照文献［10］，包括磷酸缓冲液(PBS)、缓冲蛋白胨水(BP)和营养肉汤(NB)。

1.3 仪器与设备
Autoclave SS－325型灭菌锅，日本TOMY有限公司;S·SW－CJ-IC型净化工作台，上海跃进医疗器械厂;XW-80A型漩涡混合器，上海精科实业有限公司;DHG-9203A型电热恒温鼓风干燥箱，上海华连医疗器械有限公司;HWS-150型恒温恒湿培养箱，上海比朗仪器有限公司;WAECO CF50型冰箱，美国电子(深圳)有限公司;SPX-250B-Ⅱ型生化培养箱，上海跃进医疗器械厂;HH-1型恒温水浴箱，上海鑫培仪器设备有限公司;FA2204型电子天平，上海上天精密仪器有限公司。

1.4 气单胞菌不同修复培养基的比较
取冷冻48 h的猪肉在25℃下解冻，取解冻10 min和20 min的猪肉进行平板计数，以TSAYE及NA为培养基，比较两者修复效果。

并将修复效果较好的培养基与 ASA培养基中分别接种103、104和105 CFU/mL的气单胞菌比较菌数差异。

1.5 气单胞菌损伤培养基的优化
以1.4中得出的优选培养基分别加入2%和4%的NaCl，分别用做气单胞菌生长过程中测定的计数培养基，气单胞菌培养时间12 h，每隔2 h进行取样。

比较不同盐度的气单胞菌生长曲线差异显著性，得出气单胞菌的耐盐度。

冷冻48 h的猪肉取出于25℃下解冻1 h，每组两个平行。

参照GB/T4789.2－2010平板计数法每30 min进行取样测定活菌数［10］，同时以上述优选培养基中分别添加1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%的NaCl进行平板计数，于27℃进行培养。

经差异显著性分析得到最适的气单胞菌损伤培养基。

1.6 气单胞菌不同修复介质的比较
将猪肉解冻30 min的菌悬液即可接于PBS、BP及NB修复介质中，分别在25℃、37℃恒温水浴中进行培养，于培养时间30 min和60 min进行取样，每组两个平行，分别在修复和损伤培养基中进行计数，27℃进行培养。

比较气单胞菌的修复
率如下［11］:
1.7 统计分析
应用SPSS17.0软件中方差分析不同处理的显著性分析。

2.1 气单胞菌不同修复培养基的比较
由表1中可知，猪肉解冻 10 min及 20 min TSAYE培养基的菌落数均明显高于NA培养基的数目，说明TSAYE较NA的修复效果好。

Rocello等［12］研究不
同培养基用于牛肉冷冻和加热对大肠杆菌损伤后的修复也表明TSAYE培养的菌数
最高。

从表2可以看出，TSAYE检测活菌总数也高于气单胞菌常规检测培养基ASA培养基，故可选择TSAYE培养基用于后续研究。

2.2 气单胞菌损伤培养基的优化
2.2.1 气单胞菌耐盐度的测定
气单胞菌在不同盐度培养基中的生长曲线如图1所示。

经差异显著性分析得出，TSAYE与TSAYE+2%NaCl中气单胞菌生长曲线P1=0.0563，TSAYE与
TSAYE+4%NaCl中生长曲线P2=0.0225，可知气单胞菌的耐盐度小于4%，以下损伤培养基研究探讨1% ～3%NaCl添加量的菌数差异。

2.2.2 解冻猪肉在不同损伤培养基上的计数
从图2中可以看出，菌落总数在NaCl为1%和1.5%之间无显著差异(P＞0.05)，
当NaCl浓度大于1.5%时30 min和60 min解冻的菌落数开始下降，表明盐度大于1.5%时，损伤菌生长受到抑制，因此可以1.5%NaCl为损伤培养基的适合浓度。

损伤型气单胞菌的数量可以TSAYE的菌落数与损伤培养基TSAYE+1.5%NaCl的
菌落数之差来计数。

Feeherryd等［13］研究认为，在热损伤黑曲霉菌的修复培
养基中加入不同含量的NaCl，当盐度大于0.9%时，菌落总数下降，含0.9%盐度培养基中生长的菌落数为未损伤菌的数量，其结果稍低于本研究。

2.3 气单胞菌不同修复介质的比较
冷冻损伤型气单胞菌在不同介质(PBS、BP和NB)及不同温度(25℃和37℃)下修复情况如图3和图4，损伤型气单胞菌的数量为添加1.5%NaCl前后的菌落数之差。

由图3和图4可知，损伤型气单胞菌在PBS、BP及NB中，经过25℃及37℃均
能被修复，30～60 min内修复速率加快，修复时间可能大于1 h。

25℃条件下修复培养基总数基本无变化，但37℃略有下降趋势;损伤培养基中不同介质中的菌落数也有差异。

表3中不同修复介质中损伤性气单胞菌的修复率表明，NB修复率较大，25℃修复率大于37℃，故可选NB作为液体修复介质，25℃为合适液体修复温度。

修复时间为1 h。

张勇等［3］研究了金黄色葡萄球菌的冷冻损伤修复方法，也得出金黄
色葡萄球菌的在NB中修复效果较好，但合适的培养温度为37℃。

本研究结果表明，冷冻猪肉中损伤型气单胞菌的修复可通过TSAYE培养基检测。

TSAYE可用来作为冷冻、加热、高压等处理的修复计数培养基，如大肠杆菌的冷
冻损伤、沙门氏菌的热损伤以及李斯特菌的高压损伤等。

Fátima 等［14］和Busch 等［15］分别选用TSAYE为修复培养基。

本文应用以盐度梯度为因素，因为NaCl和胆盐、去氧胆酸纳等物质都有抑制损伤菌的作用，同时，NaCl作为一
种常用的食品保鲜剂，在Fátima［14］和 Busch［15］等的李斯特菌热损伤研究中也应用过。

不过本研究结果得到的合适培养基检测冷冻损伤型气单胞菌为TSAYE+1.5%NaCl，前述李斯特菌的研究分别为 TSAYE+5%NaCl和
TSAYE+4%NaCl。

微生物修复可发生在1～6 h内，25～37℃对损伤菌的修复有利。

冷冻损伤型气单胞菌可在25℃下较好修复，修复时间大约1 h，在液体介质NB修复效果较好。

而冷冻损伤的大肠杆菌修复时间为2 h［16］，金黄色葡萄球菌经过2 h修复后，修复率最大［3］，不同种类的微生物在经过不良环境处理后，损伤的种类和程度是不同的。

低温环境会导致生物体内的酶致钝，出现暂时失活的现象，但是当温度逐渐升高，酶活会慢慢复苏，重新催化生化反应。

嗜水气单胞菌最适生长温度为28℃［17］，可见25℃有利于气单胞菌体内酶活性的恢复。

本研究同时对解冻猪肉中冷冻损伤型的气单胞菌进行了固体和液体两种修复方法。

直接用TSAYE培养基及营养琼脂进行平板计数，操作简单便捷。

而且固体修复方法可以克服液体修复方法可能会造成正常菌及杂菌繁殖的危险，对结果造成误差［18］。

因此，冷冻猪肉解冻过程损伤型气单胞菌的检测可首选用固体修复法。

从固体和液体修复及损伤培养基的优化得出TSAYE为损伤型气单胞菌的合适修复培养基，TSAYE+1.5%NaCl为合适的损伤培养基，损伤型气单胞菌的适宜修复温度为25℃，通过比较选择固体修复方法，确定了气单胞菌在液体培养基中的修复时间为1 h。

【相关文献】
［1］ Hartsell S E．The longevity and behavior of pathogenic bacteria in frozen food:the influence of plating media［J］．American Journal of Public Health，1951，41(9):1 072－1 077.
［2］ Wu V C H．A review of microbial injury and recovery methods in food［J］．Food Microbiology，2008，25(3):735－744.
［3］张勇，刘衡川，殷强仲，等．金黄色葡萄球菌－20℃冷冻损伤修复［J］．预防医学情报杂志，2005，21(3):146.
［4］ Jasson V，Uyttendaele M，Rajkovic A，et al．Establishment of procedures provoking sub-lethal injury of Listeria monocytogenes，Campylobacter jejuni and Escherichia coli O157 to serve method performance testing［J］．International Journal of Food Microbiology，2007，118(1):241－249.
［5］ Sogin S J，Ordal Z J．Regeneration of ribosomes and ribosomal ribonucleic acid during repair of thermal injury to Staphylococcus aureus ［J］． Journal of Bacteriology，
1967，94(4):1 082 －1 087.
［6］ Carol W，Clark，John Z O．Thermal injury and recovery of Salmonella typhimurium and its effect on enumeration procedures［J］．Applied Microbiology，1969，18(3):332
－336.
［7］ Warseck M，Ray B，Speck M L．Repair and enumeration of injured coliforms in frozen foods［J］．Applied Microbiology，1973，26(6):919－924.
［8］刘振民，骆承庠．乳酸菌冷冻损伤研究［J］．食品与发酵工业，2002，28(10):18－21. ［9］陈天寿．微生物培养基的制造与应用［M］．北京:中国农业出版社，1995.250－579. ［10］ GB4789.2－2010．食品卫生微生物学检验菌落总数测定［S］．
［11］ Kang D H．Developmentofmembrane alters holder(MFH)method for recovery of heat-injured Escherichia coli O157:H7 and Salmonella typhimurium［J］．The Society for Applied Microbiology，2002，34(5):62－65.
［12］ Rocelle M，Clavero S，Larry R B．Suitability of selective plating media for recovering heat or freeze-stressed Escherichia coli O157:H7 from tryptic soy broth and ground beef［J］． Applied and Environmental Microbiology，1995，61(9):3 268－3 273. ［13］ Feeherry F E，Donald T M，Durwood B．Thermal inactivation and injury of Bacillus stearothermophilus Spores［J］．Applied and Environmental Microbiology，1987，53(2):365－370.
［14］ Miller F A，Brandao T R S，Teixeira P，et al．Recovery of heat-injured Listeria innocua［J］．International Journal of Food Microbiology，2006，112(3):261 －265. ［15］ Busch S V，Donnelly C W．Development of a repair-enrichment broth for resuscitation of heat-injured Listeria monocytogenes and Listeria innocua［J］．Applied and Environmental Microbiology，1992，58(1):14－20.
［16］张勇，刘衡川，殷强仲，等．－20℃冷冻损伤大肠杆菌修复的研究［J］．中国卫生检验杂志，2005，15(3):289－292.
［17］单晓枫，郭伟生，陈畅，等．嗜水气单胞菌检测技术研究进展［J］．动物医学进展，2010，31(5):90－93.
［18］ Hara K Y，Ikedo M ，Kodaka H，etal．Selective enrichmentwith a resuscitation step for isolation of freeze-injured Escherichia coli O157:H7 from foods［J］．Applied
and Environmental Microbiology，2000，66(7):2 866 －2 872.。