成年鲁西牛肌内前脂肪细胞的分离培养

农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2007,15(3):419~423
*基金项目： 农业部 948项目(No.2006­G47)资助。

**通讯作者。

Author for correspondence.教授， 博士生导师， 主要从事反刍动物营养研究。

E­mail:<qxmeng@>. 收稿日期：
2006­10­30 接受日期： 2007­01­25 ·研究论文
· 成年鲁西牛肌内前脂肪细胞的分离培养 *
万 荣,丁 健, 周振明, 任丽萍, 孟庆翔 **
（动物营养学国家重点实验室,中国农业大学动物科技学院 /肉牛研究中心， 北京 100094）
摘要:选取来自 3 头成年育肥鲁西黄牛阉牛第 6～7肋间的肌肉内脂肪组织，
利用Ⅰ型胶原酶消化法分离获得牛肌内前脂 肪细胞。

培养出的细胞成分均一， 增殖旺盛， 倍增时间为 62h ； 体外诱导分化2d 时， 培养细胞胞质内开始有小脂滴出现， 而至第 6d 时， 细胞胞质内小脂滴明显增多， 并且有少数开始融合成大脂滴。

经形态学动态变化观察、 生长曲线、 油红 O 脂肪染色提取 法及对胰岛素和地塞米松反应的测定， 证明是功能活跃的前脂肪细胞， 并在体外重现了其增殖分化过程， 同时经染色体核型分 析分离获得的牛肌内前脂肪细胞经6次传代培养后， 其二倍体细胞数超过 90％， 基本都保留着正常细胞的基本遗传特征。

本实 验证明， 成年鲁西黄牛肌肉内群确实存在前脂肪细胞。

关键词:鲁西黄牛； 肌内前脂肪细胞；
体外培养； 大理石纹 中图分类号: S188 文献标识码: A 文章编号: 1006­1304(2007)03­0419­05
Isolation and
culture of Intramuscular Preadipocyte
from Luxi Adult Yellow Cattle*
WAN Rong,DING Jian,ZHOU Zhen­ming,REN Li­ping,MENG Qing­xiang**
当牛肉肌束和肌纤维间沉积一定脂肪时（亦即
肌内脂肪）， 其断面呈大理石状， 不仅鲜嫩， 而且柔软 多汁。

肌内脂肪是衡量牛肉品质的重要指标。

Nishimura （1999） 研究发现， 育肥期日本黑毛和 牛随着肌内脂肪含量的增加，其肉的嫩度和风味明 显改善， 背最长肌的剪切力显著降低， 而且肌内脂肪
所反映的大理石纹等级直接影响牛肉质量等级（周
光宏等， 2001）。

Albrecht （2006） 的研究结果显 示，理想大理石纹肉的形成是肌内脂肪细胞数量的
增加和体积肥大的结果。

Aso （1995） 首次分离 并建立了牛肌内前脂肪细胞系，随后便有研究者尝
试利用外源性诱导剂 （如 thiazolidinedione 、 维生素
Three Luxi adult yellow steers were used to isolate and culture intramuscular preadipocyte in vitro and examine factors
influencing their proliferation and differentiation.The intramuscular preadipocyte cells were taken from adipose tissues within muscles between sixth and seventh rib and cultured after digestion by collagenase I.The results showed that the separated cells were highly ho­ mogeneous,proliferative and doubl timed within 62h.When the confluent preadipocytes were treated with differentiation medium, small lipid droplets began to appear on day 2and the number of lipid droplets rapidly increased around the nuclei on day 6.Their dy­ namic morphological changes,growth curve,oil O staining,and reaction to insulin and dexamethasone all verified their preadipocyte identity.Under controlled conditions,the intramuscular preadipocytes replayed their proliferation and differentiation process especially,the proportion of cultured diploid preadipocytes reached to more than 90%after 6run of repeated cultures were performed. In conclusion,the current study confirms that functionally active preadipocytes indeed present within muscles of China adult local breed cattle.The cell strains will be potentially used as a useful model for further understanding of the mechanism by which the intra­ muscular adipose is deposed in the tissues,and for improving the beef quality based on local breed beef
cattle.
Luxi yellow cattle ； intramuscular preadipocyte ；
；
marbling
农 业 生 物 技 术 学 报 2007年
A等）对牛的肌内前脂肪细胞诱导分化进行研究 （Torii ,1998； Ohyama ,1998），结果发现， thiazolidinedione促进脂肪分化， 而维生素 A则抑制 脂肪分化， 且它们的作用均表现为剂量依赖性方式。

鲁西黄牛是我国优良地方品种，具有与日本黑毛和 牛相媲美的优秀肉质特性。

但到目前为止， 我国尚未 开展关于优秀地方品种黄牛脂肪沉积特性方面的研 究。

本实验目的是建立鲁西黄牛肌内前脂肪细胞系， 为后续通过反刍动物营养调控（如外源性诱导剂如 营养素）手段调控肌内脂肪发育及其研究脂肪沉积 的机制提供一种简便有效的细胞模型。

1材料和方法
1.1 材料
1.1.1组织来源 选择健康无病、 18月龄左右的育 肥后期鲁西黄牛 3头，屠宰后取第 6与第 7肋间的 肌肉组织，无菌条件下分离出所取肌肉内的脂肪组 织。

1.1.2试剂和仪器 DMEM培养基、 DPBS、 玉型胶 原酶、 胰蛋白酶和青、 链霉素原液均购自 Gibco BRL 公司， 胎牛血清 （FBS） 购自 PAA公司； 胰岛素、 地塞 米松和 HEPES均为 Sigma公司产品； 细胞培养瓶、 培养皿以及培养板皆购自 Corning公司；其余试剂 均为分析纯，购自北京化学试剂公司。

CO2培养箱 （Heraeus， Germany）、 倒置相差显微镜（Nikon， Japan）、 UV­VIS8500双光束紫外 /可见分光光度计 （天美， 上海）。

1.1.3培养基及主要试剂的配制 基础培养基： 按 产品说明取 DMEM培养粉 13.4g， NaHCO 2 3.7g， HEPES粉剂 3.57g， 加入各 100IU/mL青、 链霉素， 四蒸水定容至 1000mL， 培养时加入 10％ FBS（按 V/V）。

分化培养基： 在基础培养基内加入 10滋 g/mL 胰岛素、 0.25滋 mol/L地塞米松。

玉型胶原酶消化液： 100mg玉型胶原酶， 溶于 100mL的 DPBS中。

胰蛋 白酶消化液： 胰蛋白酶 0.25g溶于 100mL的 DPBS 中。

上述溶液均需调整 pH值至 7.2～7.4， 0.22滋 m 微孔滤膜正压过滤除菌， 分装后置于－20℃保存。

油 红 O工作液 （Ramirez­Zacarias ,1992）： 4.2g油 红 O溶于 1200mL异丙醇中， 室温静置过夜， 分析 滤纸过滤后收集滤液， 并加入 900mL三蒸水， 于 4 ℃再次静置过夜后过滤两次即可于室温贮存备用。

低渗液： 5.592g KCl，用蒸馏水溶解后定容至 1000 mL。

固定液:冰醋酸颐无水甲醇 （1颐 3）， 新鲜配置并在 冰上保存。

1.2 方法 1.
2.1鲁西黄牛肌内前脂肪细胞的分离培养 按 Aso（1995） 的方法， 无菌状态下从肌肉组织中 分离脂肪细胞。

方法： 取肌束之间的白色脂肪， 用眼 科剪和镊子去除脂肪组织块表面肉眼可见的纤维成 份、 肌肉及血管， 之后剪碎所获得的脂肪组织块约为 1mm 3大小， 并转入 50mL离心管中。

DPBS洗涤数 次后加入等体积 1mg/mL玉型胶原酶， 在 37 ℃恒温 水浴锅中消化 1h（每 5min振荡 1次）， 再用等体积 的基础培养基（含 10%FBS）中和消化液，然后用 100和 50滋 m孔径的无菌不锈钢过滤筛依次过滤消 化物。

收集滤液于另一洁净无菌的离心管中， 700
离心 5min， 去除漂浮的脂肪细胞及上清液后， 加入 含 10%FBS的基础培养基重悬沉淀细胞， 即得牛的 肌内前脂肪细胞。

经台盼蓝染色作细胞活力鉴定后， 按 5伊 10 4个 /cm 2的密度接种前脂肪细胞于 6孔培 养板中， 并置于 CO2培养箱 （37 ℃， 饱和湿度， 5% CO
2） 中培养。

培养 24h后换液， 以除去血细胞和未 贴壁的细胞， 之后每 2～3d换液 1次。

1.2.2细胞生长曲线的绘制 培养的细胞达到汇 合状态 （70%～80%）， 等量接种至 24孔培养板， 随 机分成 8个组， 且每组 3孔， 每 2d检测一组中每个 孔的细胞总数， 取 3个孔的平均植， 如此至第 8组结 束。

1.2.3体外培养的细胞染色体计数分析检测 参 考章静波和徐存拴 （2004） 的方法， 对体外培养的细 胞染色体进行分析检测。

在培养的细胞进入对数生 长期时，加入秋水仙碱溶液（终浓度 0.06～0.10滋 g/mL） 于培养箱中温育 1h左右， 用胰蛋白酶消化 液消化收集细胞于离心管中 700离心 10min， 弃 上清， 然后加入预热的 KCl低渗液 5mL于 37 ℃水 浴 20min， 低渗结束后先用 0.5mL固定液进行预固 定， 700离心 10min，收集沉淀后用 5mL固定液 固定 20min。

连续固定 3次， 离心收集的沉淀用适 量固定液重悬， 随后滴片。

待染色体标本在空气中干 燥后用 10%Giemsa溶液室温下扣染 10min，流水 冲洗后， 于室温下空气干燥， 最后显微镜下镜检。

1.2.4油红 O染色法测定细胞内脂肪含量 根据 Ramirez­Zacarias（1992） 的方法测定 2～10d细 胞内脂肪含量。

10%甲醛的等渗盐缓冲液固定培养 板贴壁细胞 1h后， 蒸馏水漂洗。

吸取油红 O工作液 2mL浸染培养板， 2h后倒掉油红 O工作液，蒸馏 水漂洗培养板数次， 直至完全漂洗干净。

将已染色的 培养板置于 32℃烘箱内， 蒸发掉培养板所有孔内的 水分， 随即加入 1.5mL异丙醇萃取 20min， 后移出 染液， 于分光光度计 510nm波长处测吸光度。

其中
420
第 3期 万 荣等:成年鲁西牛肌内前脂肪细胞的分离培养
一部分染色后于倒置相差显微镜下观察， 并照相， 采 集油红 O染色图片。

2结果
2.1 培养的鲁西黄牛肌内前脂肪细胞形态学观察
经Ⅰ型胶原酶消化获得的细胞用基础培养基培 养，细胞刚接种时胞质回缩成小圆球形，为悬浮状 态， 接种 24h后可见有部分细胞开始贴壁， 呈不规 则的三角形 （图 1,a）。

此时弃去未贴壁细胞， 加入新 鲜培养液。

培养 48h后贴壁细胞开始伸展变形， 大 多数呈现狭长梭形的成纤维样细胞形态 （图 1,b）。

当 培养细胞达到 80%左右时进行传代处理， 传代细胞 生长至汇合状态后更换为分化培养基中进行诱导分 化培养。

诱导第 2d细胞胞质内开始有小脂滴出现 （图 1,d）， 至第 6d时， 胞质内小脂滴明显增多， 并且 有少数开始融合成大脂滴 （图 1,c； 图 1,e； 图 1,f）。

2.2 鲁西黄牛肌内前脂肪细胞的生长曲线
在接种密度为 1伊 10 4个 /cm 2下， 根据司徒镇强 等 （2001） 关于培养细胞倍增时间的计算公式， 得鲁 西黄牛肌内前脂肪细胞的倍增时间为 62h（图 2）。

从图 2可以看出，鲁西黄牛前脂肪细胞生长曲线类 似 S型，符合体外培养细胞的正常生长增殖规律， 即先进入缓慢生长的潜伏期 （约 40h）， 随后到指数 生长期 （第 4～10天）， 最后达到生长停止的平台期 （第 10天后）。

2.3 培养细胞的染色体计数分析
当培养的鲁西黄黄牛肌内前脂肪细胞连续传代 至第 6次且绝大部分处于分裂中期时，进行染色体 核型分析。

选择 14个分裂相计数染色体数目（图 3）， 发现其正常比例在 90％（13/14） 以上。

结果说 明，分离获得的牛肌内前脂肪细胞经 6次传代处理 后其倍性仍然正常， 二倍体细胞占明显优势， 保留着 正常细胞的基本遗传特征。

2.4 油红 O 染色法测定细胞内脂肪含量
图 4显示，经传代培养的前脂肪细胞在分化培 养基中生长至融合状态后诱导分化 2d， 胞质内开始 积聚小脂滴， 至第 6d胞内小脂滴大量出现， 且开始 有小脂滴逐渐融合成为大脂滴，这与形态学观察的 结果基本一致。

3讨论
通过体外培养前脂肪细胞，可以深入了解脂肪 细胞的增殖分化规律，并完整地认识肌内脂肪组织 的发育及沉积机制。

然而， 研究的关键是获得染色体 倍性正常、 高度均一、 高度增殖及分化能力的前脂肪 细胞。

Aso（1995） 和 Sato（1996） 虽分离获 得了来源于牛肌肉组织内的前脂肪细胞，但所获细 胞的体外遗传特征正常与否，以及其前脂肪细胞真 实性与否， 并未进行详细验证。

而且， 以后再也未见 有关于来自成年牛肌肉组织内前脂肪细胞分离培养 的相关报道。

本研究采用玉型胶原酶消化法获得了成分均 一， 增殖和分化旺盛的梭形细胞。

经生长曲线测定、 脂肪染色， 证明它们是具有典型特征的前脂肪细胞， 符合文献中提出的 3个标准（Van ,1976）： ①来自脂肪组织， 形态为梭形， 胞浆内无或很少有脂肪 颗粒； ②增殖迅速， 与来自同一个体的成纤维细胞 在倍增时间上接近。

③在形成单层汇合后能变为脂 肪细胞，包括脂肪细胞特异性酶的出现和胞浆内出 现脂肪颗粒，并且胰岛素是这个过程中的主要促进 因素。

本实验中的脂肪组织来源于成年鲁西黄牛第 6与第 7肋间的肌肉内，分离得到的前脂肪细胞在 合适的诱导条件下能分化成充满脂滴的成熟脂肪细 胞，说明在成年动物中确实存在着具有分化能力的 前脂肪细胞， 这与 Yagi（2004） 的结果相一致。

而且，本实验分离得到的前脂肪细胞可能来源于 Carraro（1991）发现的成熟脂肪组织内都有的 一种 “细胞岛” 。

这种细胞岛内的细胞无论从分化度、 分化速度和培养条件， 均说明是均一的前脂肪细胞， 具有高分化能力， 是脂肪组织的生发中心。

原代培养 中， 在不外加胰岛素 （10滋 g/mL） 和地塞米松 （0.25
滋 mol/L） 的情况下， 发现少部分细胞能自动分化为 充满脂滴的成熟脂肪细胞，而在传代培养中则必须 有胰岛素和地塞米松的诱导。

这可能是因为本研究 中的脂肪块来源于成年个体的成熟脂肪组织，前脂 肪细胞在体内已经被激活，或是本身分离获得的前 脂肪细胞中就存在一定数量的成熟脂肪细胞，故可 观察到这种活跃的脂肪细胞新生。

脂肪细胞与成纤 维细胞一样， 均来自于中胚层， 因此培养脂肪细胞和 培养成纤维细胞应具有相似的条件，所不同的是需 促脂肪形成因子的作用。

本研究中所采用的基本培 养条件与成纤维细胞的培养完全一致， 即 37℃、 5%
CO
2及饱和湿度下培养， 这与孙超等 （2001）、 屈长青 等 （2005） 和王竹晨等 （2001） 所建立的大鼠、 猪及人 的前脂肪细胞培养条件相一致。

同时，本研究就 Rosen（2000） 指出的体外培养的前脂肪细胞系 的染色体倍性正常与否问题进行了染色体核型分 析。

结果显示， 培养的前脂肪细胞仍保留正常细胞的 基本遗传特征， 可以作为有效模型用以后续研究。

在牛肉品质的研究领域，牛肉的肌内脂肪是研
421
农 业 生 物 技 术 学 报 2007 年
图 2. 牛肌内前脂肪细胞生长曲线 Fig.2.Growth curve of intramuscular
preadipocytes cultured in vitro
图4. 鲁西黄牛前脂肪细胞分化过程中脂肪含量的变化 Fig.4.Cytoplasmic fat content changes in Luxi bovine
preadipocyte differentiation
图1. 鲁西黄牛肌内前脂肪细胞的体外培养
a. 接种 24h 的前脂肪细胞；
b. 体外培养 48h 的前脂肪细胞； c 、 d 、e 和f. 胰岛素 10滋 g/mL ＋地塞米松0.25 滋
mol/L 分别诱导分化6、 2、 6和6d ， 箭头所指为油红O 染色的脂肪滴。

Fig.1.Culture of intramuscular preadipocyte from Luxi adult yellow cattle
a.Preadipocytes cultured for 24h;
b.Preadipocytes cultured for 48hours.200× ;c,d,e and f.Bovine intramuscular
preadipocytes were respectively treated with insulin (10?g/mL)and dexamethasone (0.25?mol/L)for 6,2,6
and 6d after confluence.Intracellular lipid was stained with Oil Red
O.
图3. 鲁西黄牛肌内前脂肪细胞染色体 200伊 Fig.3.Chromosome of Luxi bovine intramuscular
preadipocytes
422
第 3期 万 荣等:成年鲁西牛肌内前脂肪细胞的分离培养
究的重点。

尤其是近年来， 有关牛肉肌内脂肪含量、 组成及其沉积规律的研究是肉品学领域的热点问题 之一。

为此，对于组成牛肌肉内脂肪组织的基本单 元——
—前脂肪细胞的增殖分化能力及其影响因素的 研究， 具有非常重要的意义。

通过本实验建立的这一 模型用以研究前脂肪细胞的增殖分化及其影响因 素， 最终有望来改善本地黄牛肌内脂肪的含量， 达到 改善牛肉品质的目的。

参 考 文 献
Albrecht E,Teuscher F,Ender K and Wegner J.Growth­and breed­related changes of marbling characteristics in cattle(J).
2006,84:1067～1075
Aso H,Abe H,Nakajima N,Ozutsumi K,Yamaguchi T, Takamori Y,Kodama A and Hoshino F B.A preadipocyte clonal line from bovine intramuscular adipose tissue: Nonexpression of GLUT­4protein during adipocyte differentiation(J).
,1995,213(2):369～375
Carraro R,Li Z H,Johnson Jr J E and Gregerman R I.Islets of preadipocytes highly committed to differentiation in cultures of adherent rat adipocytes(J). ,1991, 264(2):243～251
Nishimura T,Hattori A and Takahashi K.Structural changes in intramuscular connective tissue during the fattening of Japanese black cattle:Effect of marbling on beef tenderization(J). ,1999,77:93～ 104
Ohyama M,Matsuda K,Torii S,Matsui T,Yano H,Kawada T and Ishihara T.The interaction between vitamin A and thiazolidinedione on bovine adipocyte differentiation in primary culture(J). ,1998,76: 61～65
Qu C Q(屈长青),Zhang G H(张国华),Chen F F(陈粉粉), Zhao L L(赵丽丽)and Yang G S(杨公社).Primary culture of porcine preadipocyte(J).
(农业生物技术学报),2005,13(5):649～653 (in Chinese with English abstract)
Ramirez­Zacarias J L,Castro­Munozledo F and Kuri­Harcuch W.Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with oil red O(J).
,1992,97:493～497
Rosen E D,Walkey C J,Puigserver P,and Spiegelman B M.
Transcriptional regulation of adipogenesis(J).
,2000,14:1293～1307
Sato K,Nakanishi N and Mitsumoto M.Culture conditions supporting adipose conversion of stromal­vascular cells from bovine intramuscular adipose tissues(J).
,1996,58(11):1073～1078
SiTu Z Q(司徒镇强).Cell Culture(M).Xian:World Publishing Co,Ltd,2001.(in Chinese)
Torii S,Kawada T,Matsuda K,Matsui T,Ishihara T and Yano
H.Thiazolidinedione induces the adipose differentiation of
fibroblast­like cells resident within bovine skeletal muscle(J).
,1998,22(6):421～427
Sun C(孙超).Regulation of mice preadipocytes’proliferation and differentiation by ECM components and cAMP.Ph.D Thesis,Northwest A＆F University2001.(in Chinese)
Van R L R,Bayliss C E and Roncari D A K.Cytological and enzymological characterization of human adult adipocyte precursors in culture(J). , 1976,58:699～704
Wang Z C(王竹晨),Liu J Z(刘建中),Li Y(李燕),Yang D Z (杨冬梓)and Kuang J Q(邝健全).Primary culture of human preadipocyte(J).
(中山医科大学学报),2001,22(6): 443～447(in Chinese with English abstract)
Yagi K,Kondo D,Okazaki Y and Kano K.A novel preadipocyte cell line established from mouse adult mature adipocytes(J).
,2004,321:967～974
Zhang J B(章静波),and Xu C S(徐存拴).Culture of Animal Cells(M).Beijing:Science Publishing Co,Ltd,2004.(in Chinese)
Zhou G H(周光宏),Liu L(刘丽),Sun B G(孙宝忠),Xu X L (徐幸莲 ), ..The methods and standard of the beef grading system(J). (肉类工业),2001,241
(6):41～51(in Chinese)
423。