盐析沉淀蛋白质时
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• 大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。 • 这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸
收。 • 利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。 • 初步定量，若精细定量用考马斯亮蓝染色
蛋白质的分离与纯化方法
分离纯化之前保证蛋白质一定的纯度 依据：大小、形状、溶解度、酸碱性、吸附性及对配体的亲和性 若要研究蛋白质的功能则要求高级结构完整 难度大，迄今几百个蛋白质的单晶（单晶的天然结构都没有发生变化）
最准确可靠的方法是超离心法（Svedberg于1940年设计）：蛋白质颗粒在25-50*104 g离心力作 用下从溶液中沉降下来。
沉降系数（s）：单位（cm）离心场里的沉降速度。
v s = ————
ω2x
v =沉降速度（dx/dt） ω=离心机转子角速度（弧度/s） x =蛋白质界面中点与转子中心的距离（cm）
（一）盐析与有机溶剂沉淀： 盐溶
1. 盐析： 在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称 为盐析。
常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。 盐析时，溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好。 盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。
分段盐析： 半饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆球蛋白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆清蛋白。
乙醛酸试剂及浓 H2SO4
α-萘酚、NaClO
紫色 红色
N 胍基
酚试剂反应 (Folin-Cioculteu 反 应)
茚三酮反应
碱性CuSO4及磷钨 酸-钼酸 茚三酮
蓝色 蓝色
酚基、吲哚基 自由氨基及羧基
有此反应的 蛋白质或氨 基酸 所有蛋白质
Tyrห้องสมุดไป่ตู้
Tyr、Phe Trp
Arg
Tyr
α-氨基酸
5、蛋白质的紫外吸收
阳离子 PH<PI
兼性离子 PH=PI
阴离子 PH>PI
没有盐类干扰时的等 电点叫等离子点
可解离基团有末端和侧链 故pI与酸性、碱性氨基酸的数目有关 如胃蛋白酶酸性氨基酸多，等电点偏酸性 有些球蛋白的可解离基团只有变性后才能完全滴定
2、蛋白质的胶体性质：
蛋白质分子的颗粒直径已达1-100nm，处于胶体颗粒的范围。因此，蛋白质具有亲水溶胶的性质。 由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。
4）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。
5）平板电泳：铺有凝胶的玻板上进行的电泳。
—
+ +
两种凝胶电泳
等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。分离同工酶
－ － －－
++ －－
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7.0
6.0 5.0
通电
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6.0 － －
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蛋白质的变性 一、蛋白质在某些理化因素的作用下，其空间结构受到破坏，从而改变其理化性质，并失去其生物活性，称 为蛋白质的变性。
二、变性的实质是破坏了蛋白质的空间结构，并不引起一级结构的改变。 三、蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀，但沉淀的蛋白质不一定都变性后的蛋白质。
四、加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为凝固。因此，凡凝固的蛋白质一定发生变性。
盐析沉淀蛋白质时
1、酸碱性质
蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电 场中不移动。 在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带正电荷， 在电场中向负极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动。这 种现象称为蛋白质电泳
2. 有机溶剂沉淀蛋白质：
凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀蛋白质。 沉淀原理是：① 脱水作用；② 使水的介电常数降低，蛋白质溶解度降低。
（二）电泳：
带电粒子在电场中移动的现象称为电泳（electrophoresis) 蛋白质分子在溶液中可带净的负电荷或带净的正电荷，故可在电场中发生移动。不同的蛋白质分子所 带电荷量不同，且分子大小也不同，故在电场中的移动速度也不同，据此可互相分离。
蛋白质的胶体性质 布郎运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透膜，具有吸附能力
蛋白质溶液稳定的原因：1）表面形成水膜（水化层）； 3)大小为1-100nm的胶体颗粒
2）带相同电荷。
+
+
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蛋白质的沉淀作用
蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。 改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质 在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。
蛋白质的表征 酶活力是指酶催化某一化学反应的能力。酶促反应速率 酶（活力）单位：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量。（U/g，U/ml）
在最适的反应条件（25℃）下，每分钟内催化一微摩尔底物转化为产物的酶量定为一个酶活力单位，即 1IU=1μmol/min
在最适条件下，每秒钟内使一摩尔底物转化为产物所需的酶量定为1kat单位，即 1kat=1mol/s
可逆沉淀
在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又 称为非变性沉淀。 可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和条件有机溶剂沉淀法等。
不可逆沉淀
在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产 生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。 由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 如加热沉淀、强酸碱沉淀、常温有机溶剂、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。
蛋白质在等电点pH条件下， 不发生电泳现象。利用蛋白 质的电泳现象，可以将蛋白 质进行分离纯化。
电泳
1. 自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。 2.区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。 （1）纸上电泳：用滤纸作支持物。 （2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。 （3）双向电泳
凝胶过滤分离蛋白质
（四）超速离心：
利用物质密度的不同，经超速离心后，分布于不同的液层而分离。 超速离心也可用来测定蛋白质的分子量，蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比。
蛋白质相对分子量在10 000-1 000 000之间。测定分子量的主要方法有渗透压法、超离心法、凝胶 过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
－+
5.0
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SDSPAGE中SDS的作用： 阴离子去污剂，变性，蛋白质伸展态 屏蔽蛋白质的电荷，都带负电荷 使得蛋白质的形状趋于一致
所以在这种特殊的电泳中，迁移率与蛋白质电荷无关，与蛋白质的形状无关，处决于蛋 白质的大小（分子量）
（三）层析：
层析（chromatography)是一种利用混合物中各组分理化性质的差异，在相互接触的两相（固定 相与流动相）之间的分布不同而进行分离分析的技术方法。 主要的层析技术有离子交换层析，凝胶层析，吸附层析及亲和层析、HPLC等。
1kat = 6×107IU
酶的纯度： 比活力 = 活力单位数/ 毫克蛋白（氮）
每次比活力 纯化倍数 = ——————
第一次比活力
每次总活力 产率%（回收率）= —————— ×100
第一次总活力
酶的纯化鉴定：聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法
汇报结束
谢谢大家! 请各位批评指正
沉降系数的单位常用S，1S=1×10-13（s）
蛋白质分子量（M）与沉降系数（s）的关系
RTs M = ——————
D（1－Vρ）
R——气体常数（8.314×107ergs·mol -1 ·度-1） T——绝对温度 D——扩散常数（蛋白质分子量很大，离心机转速很快，则忽略不计） V——蛋白质的微分比容（m3·g-1） ρ——溶剂密度（20℃，g·ml-1） s——沉降系数
4、蛋白质的颜色反应：鉴定蛋白质的量
反应名称
试剂
颜色
反应有关基团
双缩脲反应
NaOH、CuSO2
紫色或粉红 色
二个以上肽键
米伦反应 黄色反应
HgNO3、Hg(NO3)2 及HNO3混合物 浓HNO3及NH3
红色 黄色、橘色
—OH
乙醛酸反应 (Hopking-Cole反应)
坂口反应 (Sakaguchi反应)
1. 加高浓度盐类（盐析）：加盐使蛋白质沉淀析出。
2.
分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。血清球蛋白
（50%(NH4)2SO4饱和度），清蛋白（饱和(NH4)2SO4)。
2. 加有机溶剂
3. 加重金属盐
4. 加生物碱试剂
单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸能沉淀生物碱，称生物碱试剂。
收。 • 利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。 • 初步定量，若精细定量用考马斯亮蓝染色
蛋白质的分离与纯化方法
分离纯化之前保证蛋白质一定的纯度 依据：大小、形状、溶解度、酸碱性、吸附性及对配体的亲和性 若要研究蛋白质的功能则要求高级结构完整 难度大，迄今几百个蛋白质的单晶（单晶的天然结构都没有发生变化）
最准确可靠的方法是超离心法（Svedberg于1940年设计）：蛋白质颗粒在25-50*104 g离心力作 用下从溶液中沉降下来。
沉降系数（s）：单位（cm）离心场里的沉降速度。
v s = ————
ω2x
v =沉降速度（dx/dt） ω=离心机转子角速度（弧度/s） x =蛋白质界面中点与转子中心的距离（cm）
（一）盐析与有机溶剂沉淀： 盐溶
1. 盐析： 在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称 为盐析。
常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。 盐析时，溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好。 盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。
分段盐析： 半饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆球蛋白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆清蛋白。
乙醛酸试剂及浓 H2SO4
α-萘酚、NaClO
紫色 红色
N 胍基
酚试剂反应 (Folin-Cioculteu 反 应)
茚三酮反应
碱性CuSO4及磷钨 酸-钼酸 茚三酮
蓝色 蓝色
酚基、吲哚基 自由氨基及羧基
有此反应的 蛋白质或氨 基酸 所有蛋白质
Tyrห้องสมุดไป่ตู้
Tyr、Phe Trp
Arg
Tyr
α-氨基酸
5、蛋白质的紫外吸收
阳离子 PH<PI
兼性离子 PH=PI
阴离子 PH>PI
没有盐类干扰时的等 电点叫等离子点
可解离基团有末端和侧链 故pI与酸性、碱性氨基酸的数目有关 如胃蛋白酶酸性氨基酸多，等电点偏酸性 有些球蛋白的可解离基团只有变性后才能完全滴定
2、蛋白质的胶体性质：
蛋白质分子的颗粒直径已达1-100nm，处于胶体颗粒的范围。因此，蛋白质具有亲水溶胶的性质。 由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。
4）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。
5）平板电泳：铺有凝胶的玻板上进行的电泳。
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两种凝胶电泳
等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。分离同工酶
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通电
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蛋白质的变性 一、蛋白质在某些理化因素的作用下，其空间结构受到破坏，从而改变其理化性质，并失去其生物活性，称 为蛋白质的变性。
二、变性的实质是破坏了蛋白质的空间结构，并不引起一级结构的改变。 三、蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀，但沉淀的蛋白质不一定都变性后的蛋白质。
四、加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为凝固。因此，凡凝固的蛋白质一定发生变性。
盐析沉淀蛋白质时
1、酸碱性质
蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电 场中不移动。 在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带正电荷， 在电场中向负极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动。这 种现象称为蛋白质电泳
2. 有机溶剂沉淀蛋白质：
凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀蛋白质。 沉淀原理是：① 脱水作用；② 使水的介电常数降低，蛋白质溶解度降低。
（二）电泳：
带电粒子在电场中移动的现象称为电泳（electrophoresis) 蛋白质分子在溶液中可带净的负电荷或带净的正电荷，故可在电场中发生移动。不同的蛋白质分子所 带电荷量不同，且分子大小也不同，故在电场中的移动速度也不同，据此可互相分离。
蛋白质的胶体性质 布郎运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透膜，具有吸附能力
蛋白质溶液稳定的原因：1）表面形成水膜（水化层）； 3)大小为1-100nm的胶体颗粒
2）带相同电荷。
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蛋白质的沉淀作用
蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。 改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质 在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。
蛋白质的表征 酶活力是指酶催化某一化学反应的能力。酶促反应速率 酶（活力）单位：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量。（U/g，U/ml）
在最适的反应条件（25℃）下，每分钟内催化一微摩尔底物转化为产物的酶量定为一个酶活力单位，即 1IU=1μmol/min
在最适条件下，每秒钟内使一摩尔底物转化为产物所需的酶量定为1kat单位，即 1kat=1mol/s
可逆沉淀
在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又 称为非变性沉淀。 可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和条件有机溶剂沉淀法等。
不可逆沉淀
在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产 生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。 由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 如加热沉淀、强酸碱沉淀、常温有机溶剂、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。
蛋白质在等电点pH条件下， 不发生电泳现象。利用蛋白 质的电泳现象，可以将蛋白 质进行分离纯化。
电泳
1. 自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。 2.区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。 （1）纸上电泳：用滤纸作支持物。 （2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。 （3）双向电泳
凝胶过滤分离蛋白质
（四）超速离心：
利用物质密度的不同，经超速离心后，分布于不同的液层而分离。 超速离心也可用来测定蛋白质的分子量，蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比。
蛋白质相对分子量在10 000-1 000 000之间。测定分子量的主要方法有渗透压法、超离心法、凝胶 过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
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SDSPAGE中SDS的作用： 阴离子去污剂，变性，蛋白质伸展态 屏蔽蛋白质的电荷，都带负电荷 使得蛋白质的形状趋于一致
所以在这种特殊的电泳中，迁移率与蛋白质电荷无关，与蛋白质的形状无关，处决于蛋 白质的大小（分子量）
（三）层析：
层析（chromatography)是一种利用混合物中各组分理化性质的差异，在相互接触的两相（固定 相与流动相）之间的分布不同而进行分离分析的技术方法。 主要的层析技术有离子交换层析，凝胶层析，吸附层析及亲和层析、HPLC等。
1kat = 6×107IU
酶的纯度： 比活力 = 活力单位数/ 毫克蛋白（氮）
每次比活力 纯化倍数 = ——————
第一次比活力
每次总活力 产率%（回收率）= —————— ×100
第一次总活力
酶的纯化鉴定：聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法
汇报结束
谢谢大家! 请各位批评指正
沉降系数的单位常用S，1S=1×10-13（s）
蛋白质分子量（M）与沉降系数（s）的关系
RTs M = ——————
D（1－Vρ）
R——气体常数（8.314×107ergs·mol -1 ·度-1） T——绝对温度 D——扩散常数（蛋白质分子量很大，离心机转速很快，则忽略不计） V——蛋白质的微分比容（m3·g-1） ρ——溶剂密度（20℃，g·ml-1） s——沉降系数
4、蛋白质的颜色反应：鉴定蛋白质的量
反应名称
试剂
颜色
反应有关基团
双缩脲反应
NaOH、CuSO2
紫色或粉红 色
二个以上肽键
米伦反应 黄色反应
HgNO3、Hg(NO3)2 及HNO3混合物 浓HNO3及NH3
红色 黄色、橘色
—OH
乙醛酸反应 (Hopking-Cole反应)
坂口反应 (Sakaguchi反应)
1. 加高浓度盐类（盐析）：加盐使蛋白质沉淀析出。
2.
分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。血清球蛋白
（50%(NH4)2SO4饱和度），清蛋白（饱和(NH4)2SO4)。
2. 加有机溶剂
3. 加重金属盐
4. 加生物碱试剂
单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸能沉淀生物碱，称生物碱试剂。