细菌总DNA提取以及凝胶电泳检测

实验名称：细菌总DNA提取、凝胶电泳检测姓名：
学号：
系别：
实验日期：
同组同学名单：
摘要：本试验通过提取细菌总DNA，并进行凝胶电泳检测，使我们学习到了细菌总DNA提取的原理和方法以及琼脂糖凝胶电泳方法
实验目的：
1.学习细菌总DNA提取的原理和方法
2.学习琼脂糖凝胶电泳方法
实验材料：
1.菌种：E. coli
2.试剂：TE、溶菌酶溶液（20mg/ml）、10% SDS、蛋白酶K（20mg/ml）、5mol/L
NaCl 、酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)、乙醇
3.仪器：高速台式离心机、紫外检测仪
4.其他材料：离心管、无菌吸头、移液器等
实验方法及步骤：
1.取1.2ml细菌培养液，6000r/min 离心2min，去上清。

2.加1.5ml溶菌酶溶液，做成悬液。

3.37℃水浴20 min
4.加入0.6ml 10%SDS（0.1mol/l Nacl，0.5mol/l Tris，10%SDS，pH=8）反复
颠倒混匀10min，10000r/min离心10min，取上清（分两管，每管各0.6ml）5.用等体积苯酚：氯仿：异戊醇各抽提1次，混合均匀（颠倒50次），10000r/min
离心10min，吸上清0.4ml。

6.加入10μl的3mol/l乙酸钠和0.8ml无水乙醇，-20℃沉淀DNA10min，
12000r/min 离心10min，去上清。

7.加入70%乙醇2ml，转动离心管，倒去液体，待乙醇挥发后（20min），用30μl
TE溶解
8.用移液器吸取总DNA 4μl于封口膜上，再加入1μl 的6X载样缓冲液，混
匀后，小心加入点样孔
9.打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，
电泳约30min-60min
10.电泳结束后取出凝胶，置EB 溶液中染色5~10min，清水漂洗
11.将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上防护观察罩，打开紫外灯，可
见到发出荧光的DNA条带
实验结果：
下图中标记“四1”的为我们所提取DNA条带，可见一条清晰条带，呈现一条迁移率很小的整齐条带。

前端有大量DNA分子，稍亮。

实验结果分析：
本实验提取到的总DNA通过电泳分析证明DNA含量水平合适，可以用于PCR 实验。

琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。

DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。

不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。

大肠杆菌是革兰氏阴性菌，其细胞壁薄、肽聚糖含量低。

经过溶菌酶处理后，肽聚糖的1，4-糖苷键断裂，细胞壁裂开，同时经过NaOH和阴离子去污剂SDS 处理，使细胞膜崩解，从而达到菌体的充分的裂解。

在有机溶剂（酚、氯仿）存在时，核酸结合蛋白会发生变性，从核酸分子上解离下来，而由于核酸分子携带有大量负电荷，极性较强，当体系分相时会保留在水相中。

在实验过程中，由于细菌裂解后受到剪切力或核酸降解酶的作用，染色体DNA容易被切断成为各种大小不同的碎片而与质粒DNA共同存在，因此，采用乙醇沉淀法得到的DNA除含有质粒DNA外，还可能有少部分染色体DNA和RNA，经过电泳扩散后，RNA的扩散速度比较快，故会出现在条带最前端，总DNA由于扩散速度慢，离点样孔较近的地方分布较多。

本次试验中，要注意离心管不可剧烈震动，防止过多断裂；同时，加入有机溶剂分层后，要注意吸取上层水层。

思考题
1.为什么DNA提取时，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的方法有所不同？
我们在提取DNA时，首先就是要破坏细胞壁。

革兰氏阴性细菌因其壁薄、肽聚糖含量低和交联松散，可以直接使用溶菌酶。

但革兰氏阳性菌由于细胞壁厚、肽聚糖含量较高和其分子交联度较紧密，在加入溶菌酶之前往往还需要加入一些物质，例如青霉素、增强菌体细胞壁的敏感性。

2.影响DNA迁移率的因素有那些？
1)DNA分子的大小
2)琼脂糖浓度、种类
3)DNA的构象：超螺旋环状、切口环状、线状
4)电压：
低电压下，分离效果较好。

在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。

但是，在电场强度增加时，不同分子量的DNA 段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。

要使大于2kb的DNA段的分辨率达到最大电场强度不宜高于5—8V/cm。

5) 电泳缓冲液
DNA的泳动还受到电泳缓冲液的组成和离子强度的影响。