课题2微生物的实验室培养

三、菌落：
• 单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖 时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定 形态结构的子细胞群体，叫做菌落。 • 菌落是鉴定菌种的重要依据。
四、实验操作
(一)制备牛肉膏蛋白胨培养基(用于培养细菌)
牛肉膏蛋白胨固体培养基配方 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g NaCl 5.0g 琼脂 20.0g 将上述物质溶解后，添加自来水，定 容至1000mL
病毒:
无细胞结构
原核细胞 原核生物 : 细菌、蓝藻 微生物 的类群 原生生物： 单细胞的动植物 真核细胞
如草履虫、单细胞藻类等
真菌:
如酵母菌
课题1
微生物的实验室培养 1.提供营养和条件 2.防止污染
一.培养基：微生物生存的环境和营养物质 思考：微生物“吃”什么？ 1.基本成分：碳源、氮源、水、无机盐
注意：
移液管需要经过灭菌。操作时，
试管口和移液管离火焰1~2cm处.
问题讨论
涂布平板的所有操作都应在火焰附 近进行。结合平板划线与系列稀释的无 菌操作要求，想一想，第2步应如何进行 无菌操作？
应从操作的各个细节保证“无 菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离 要合适、吸管头不要接触任何其他物 体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。
本课题知识小结:
操作步骤
1．计算、称量 2．溶化 3．调pH： pH7．6 4．过滤：这一步可以省去。 5．分装：分装过程中注意不要使培 养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉 塞而引起污染。分装三角烧瓶的量以 不超过三角烧瓶容积的一半为宜。 6．加塞 7．包扎
8．灭菌: 将50ml培养基用玻棒转移至三角 锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸， 再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为 100kPa、温度为121℃，灭菌15～ 30min。将培养皿用旧报纸包裹，放 入干热灭菌箱内，在160～170 ℃下灭 菌2h。
答：可以用手触摸盛有培养基 的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降 到刚刚不烫手时，就可以进行倒平 板了。
2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通 过火焰？
答：通过灼烧灭菌，防止瓶 口的微生物污染培养基。
3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
答：平板冷凝后，皿盖上会 凝结水珠，凝固后的培养基表面 的湿度也比较高，将平板倒置， 既可以使培养基表面的水分更好 地挥发，又可以防止皿盖上的水 珠落入培养基，造成污染。
1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前 都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需 要灼烧接种环吗？为什么？ 答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种 环上可能存在的微生物污染培养物； 每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束 后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种 环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过 划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减 少，以便得到菌落； 划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上 残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
稀释涂布平板法
1.将分别盛有9mL水的6支试管灭菌， 并按101~106的顺序编号。
2.用移液管吸取1mL培养的菌液，注入第 二支试管中。用手指轻压移液管上的橡皮 头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀。
3.从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注 入102倍稀释的试管中，重复第2步的操作。 依次类推，直到完成最后一支试管的稀释。
倒平板技术
1.将灭过菌的 培养皿放在火 焰旁的桌面上， 右手拿装有培 养基的锥形瓶， 左手拨出棉塞。
1
2
3
4
倒平板技术
2.右手拿锥形 1 2
瓶，使瓶口迅
速通过火焰。
3
4
倒平板技术
1
2
3
4
ห้องสมุดไป่ตู้
3.用左手的拇指 和食指将培养皿 打开一条稍大于 瓶口的缝隙，右 手将锥形瓶中的 培养基(约10~ 20mL)倒入培养 皿，左手立即盖 上培养皿的皿盖。
牛肉膏蛋白胨培养基 是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。
1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方
琼脂20.0g 牛肉膏 蛋白胨 5g 10g
Nacl
H2O 分析营养构成？
5g
定容至1000ml
二.无菌技术：防止外来杂菌的污染
1.消毒与灭菌： 消毒 灭菌
较为温和理化方法， 强烈的理化方法， 定义 杀死部分有害菌体 杀死所有微生物 （不包括芽孢、孢子） （包括芽孢、孢子） 煮沸消毒法 100℃、5~6min 巴氏消毒法 70~75℃、30min 方法 化学药剂 80℃、15min 酒精、氯气、石炭酸等 紫外线 灼烧灭菌 接种环、接种针等 干热灭菌 金属用具 耐高温需保持干燥的 高压蒸汽灭菌 物品，160～170℃ 培养基， 1 ～2小时 100KPa、 121℃、15～30min
课题背景
• 酿造业在生产过程中，出现了葡萄酒变 酸、变味的怪事。 • 巴斯德发现，导致生产失败的根源在于 发酵物中混入了杂菌。 • 因此，防止杂菌入侵，获得纯净的培养 物，是研究和应用微生物的前提。 • 回忆:制作果酒时，我们的哪些操作是防 止杂菌污染发酵液的？
到目前为止， 几十项Nobel生理学和医学奖，化学奖 都与微生物学有关。
4.在倒平板的过程中，如果不小 心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部 位，这个平板还能用来培养微生物吗？ 为什么？
答：空气中的微生物可能 在皿盖与皿底之间的培养基上滋 生，因此最好不要用这个平板培 养微生物。
（二）纯化大肠杆菌
微生物的接种技术： 接种方法有： 平板划线法和稀释涂布平板法
平板划线的操作方法
⑴碳源
CO 、 CO 无机碳源： 2 3 、HCO3 有机碳源： 牛肉膏、蛋白胨等
2
-
自养微生物 异养微生物
NH4＋、NO3无机氮源： ⑵氮源 有机氮源： 牛肉膏、蛋白胨、尿素等
一.培养基：微生物生存的环境和营养物质
1.基本成分：碳源、氮源、水、无机盐 2.特殊营养：维生素、碱基等 （牛肉膏、蛋白胨中含有） 3.pH、氧气的需求： 4.种类：物理性质： 半固体培养基 有无 液体培养基 固体培养基 凝固剂琼脂 分离 化学成分： 天然培养基 工业 鉴定 合成培养基 生产
问题讨论
1.培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃ 左右时，才能用来倒平板。你用什么办 法来估计培养基的温度？
答：可以用手触摸盛有培养基 的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降 到刚刚不烫手时，就可以进行倒平 板了。
问题讨论
1.培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃ 左右时，才能用来倒平板。你用什么办 法来估计培养基的温度？
一旦划破，一会造成划线不均匀， 难以达到分离单菌落的目的； 二是存留在划破处的单个细胞无法形 成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长， 会形成一个条状的菌落。
一旦划破，一会造成划线不均匀，难 以达到分离单菌落的目的； 二是存留在划破处的单个细胞无法形 成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生 长，会形成一个条状的菌落。
二.无菌技术：防止外来杂菌的污染
1.消毒与灭菌：
2.无菌范围：实验操作空间消毒 操作者的手、衣着消毒 实验用具灭菌 实验操作过程
酒精灯旁操作 超净工作台
1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物 被其他外来微生物污染外，还有什么目的？ 答：无菌技术还能有效避免操作者自 身被微生物感染。
2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭 菌。如果需要，请选择合适的方法。 （1） 培养细菌用的培养基与培养皿 （2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管 （3） 实验操作者的双手 答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。
2.在灼烧接种环之后，为什么要等其 冷却后再进行划线？ 答：以免接种环温度太高，杀死菌种。 3.在作第二次以及其后的划线操作时， 为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
答：划线后，线条末端细菌的数目比线 条起始处要少，每次从上一次划线的末端开 始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而 逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来 的菌落。
微生物的恒温培养
微生物的恒温培养
微生物的恒温培养
菌种的保存
1.临时保藏： 接种到固体斜面培 养基，菌落长成后置 于4℃冰箱保存。 2.长期保存： 甘油冷冻管藏法
四、课题成果评价
（一）培养基的制作是否合格 如果未接种的培养基在恒温箱中
保温1～2 d后无菌落生长，说明培
养基的制备是成功的，否则需要重
新制备。
（二）接种操作是否符合无菌要求
如果培养基上生长的菌落的颜色、 形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌 菌落的特点，则说明接种操作是符合要 求的；如果培养基上出现了其他菌落， 则说明接种过程中，无菌操作还未达到 要求，需要分析原因，再次练习。
（三）是否进行了及时细致的观察与记录
培养12 h与24 h后的大肠杆菌菌落的 大小会有明显不同，及时观察记录的同学 会发现这一点，并能观察到其他一些细微 的变化。这一步的要求主要是培养学生良 好的科学态度与习惯。
倒平板技术
4.等待平板冷 却凝固，大约 需5~10min。 然后，将平板 倒过来放置， 使皿盖在下， 皿底在上。
1
2
3
4
9．倒平板: 待培养基冷却到50 ℃左右时，在酒 精灯附近倒平板。（倒平板操作见课本） 10．无菌检查： 将灭菌的培养基放入37℃的温室中培 养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。