鸡病毒性呼吸道病原多重RTPCR检测方法的建立
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浓度为３．０ｍＭ，ｄＮＴＰ浓度为０．０９Ｕ／ｕ １，退火温度为５８。Ｃ，引物浓度分别为Ｏ．３２ｐｍｏｌ
／ｕ Ｌ（ＮＤＶ）、０．３２ ｐｍｏｌ／ｔａ Ｌ（ＩＢＶ）、０．２４ｐｍｏｌ／ｕ Ｌ（Ｈ５）、０．２４ｐｍｏｌ／ｌａ Ｌ（Ｈ９），
优化后的结果能够很好的鉴别诊断这四种病毒以及这四种病毒的混合感染。
３．４种禽类呼吸道病原多重ＲＴ－ＰＣＲ方法的建立和初步应用
李白力副教授
刘梅副教授 肖运才副教授 栗绍文副教授 孟宪荣讲师
金卉 专业：预防兽医学 获得学位名称：农学硕士 讲师
研究方向：兽医微生物与免疫学 获得学位时间：２０１２年６月
华中农业大学动物医学院 二Ｏ一二年六月
华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书
㈣Ｊ｜｜Ｊ｜ＪＪＪＩＩ㈣ＩＩｆｊＪ ＪｊＪＪＪｌＪ｜ｆＪＪＩＪ｜｜…洲
１
文献综述………………………………………………………………………………】 １．１多重ＰＣＲ技术简介………………………………………………………………．１
１．１．１
ＰＣＲ技术的概述………………………………………………………………１
１．１．２提高ＰＣＲ反应特异性方法的概述…………………………………………．．１
４．１．４普通ＰＣＲ优化结果…………………………………………………………・２３ ４．２多重ＰＣＲ体系的条件优化………………………………………………………２４
４．２．１
Ｍ９２＋浓度的优化………………………………………………………………２４
４．２．２四种引物浓度比的优化………………………………………………………２５
研究生签名：姗莞
时间：如协年秒占月渤ｊ
学位论文使用授权书
本人完金了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，为存在馆际合作关系的兄弟高校用户提供文献传递和交换服务，同时 本人保留在其他媒体发表论文的权力。 注：保密学位论文（即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文）在解密后适用于本授权书。
学位论文 是否保密
否
如需保密，解密时间
年
月
日
独创性声明
本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。
ｌａｒｙｎｇｏｔｒａｃｈｅ．
ＩＢ）以及禽流感（Ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，ＡＩ）的Ｈ５、Ｈ９亚型是一类在临床上有相似呼吸 道症状的病毒性传染病，均属于ＲＮＡ病毒，仅根据临床症状和病理表现很难准确及
时作出诊断。不同的病毒感染其后续的处置方案亦不相同，延误诊断时间或误诊均 能给养鸡企业造成重大经济损失。因此，本实验拟建立ＮＤ．ＩＢ．ＡＩＨ５．ＡＩＨ９ ４种禽类 呼吸道病原的多重ＲＴ－ＰＣＲ鉴别诊断方法，并对其特异性和敏感性进行检测，为临
２研究目的与意义……………………………………………………………………・１２ ３材料与方法…………………………………………………………………………・１３
３．１实验材料…………………………………………………………………………・１ ３ ３．１．１禽呼吸道疾病病原病毒株…………………………………………………一１３ ３．１．２主要试剂……………………………………………………………………一１３ ３．１．３主要器材……………………………………………………………………一１３ ３．１．４载体及菌株…………………………………………………………………一１４ ３．１．５试剂配制……………………………………………………………………．－１４ ３．２实验方法…………………………………………………………………………・１ ５ ３．２．１引物的设计以及合成………………………………………………………．Ｉ
ｃａｕｓｅ
ｔｈｅ ｄｅａｔｈ ｏｆ
ａ
ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ ｄａｙ—ｏｌｄ ｃｈｉｃｋｅｎｓ．Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ
４．１普通ＰＣＲ体系的初步建立………………………………………………………２２
４．１．１退化温度的优化………………………………………………………………２２ ４．１．２引物浓度优化…………………………………………………………………２２
４．１．３
ＰＣＲ产物序列的测定…………………………………………………………２３
３．２．２ １５
ＲＴ－ＰＣＲ模板的制备…………………………………………………………。１ ６
３．２．３普通ＰＣＲ体系的初步建立…………………………………………………１ ７ ３．２．４多重ＰＣＲ体系的条件优化…………………………………………………１９
华中农业大学２０１２届硕士学位论文
３．２．５特异性试验……………………………………………………………………２０ ３．２．６敏感性试验……………………………………………………………………２１ ３．２．７临床诊断………………………………………………………………………２１ ４实验结果……………………………………………………………………………一２２
关键词：多重ＲＴ－ＰＣＲ；ＮＤＶ；ＩＢＶ；ＡＩＶ－Ｈ５亚型；ＡＩＶ－Ｈ９亚型；
鸡病毒性呼吸道病原多重ＲＴ．ＰＣＲ检测方法的建立
ＡＢＳＴＲＡＣＴ
Ｃｈｉｃｋｅｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｈｉｃｋｅｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｉｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｐａｔｈｏｇｅｎ
床上提供特异性强、敏感性高且省时省力的实验室鉴别诊断方法，其主要试验结果
如下：
１．４种禽类呼吸道病原扩增引物的设计和扩增方法的建立
根据ＮＤＶ的Ｆ基因片段，ＩＢＶ的Ｎ基因片段以及ＡＩＶ的Ｈ５、Ｈ９亚型的ＨＡ 基因片段设计引物，对四对引物分别进行梯度ＲＴ－ＰＣＲ扩增，在此基础上选择合适 的ＲＴ－ＰＣＲ的退火温度同时对四对引物分别进行引物浓度的优化，确定普通ＲＴ－ＰＣＲ 的退火温度为５８℃，，引物浓度为别为０．３２ｐｍｏｌ／ｌａ Ｌ（ＮＤＶ）、０．３２ ｐｍｏｌ／ｌａ Ｌ（ＩＢＶ）、 ０．２４ｐｍｏｌ／ｐ Ｌ（Ｈ５）、０．２４ｐｍｏｌ／ｌａ Ｌ（Ｈ９）。最后设计的四对引物、优化的退火温度 和引物浓度能够通过普通ＲＴ－ＰＣＲ技术特异性扩增ＮＤＶ、ＩＢＶ、ＡＩＶ的Ｈ５、Ｈ９亚
５
讨｛仑……………………………………………………………………………………………………………．３２ ５．１多重ＲＴ－ＰＣＲ检测方法的优势…………………………………………………．．３２ ５．２多重ＲＴ－ＰＣＲ引物设计的讨论…………………………………………………．．３２ ５．３多重ＲＴ－ＰＣＲ条件优化的讨论…………………………………………………．．３３ ５．４特异性试验和敏感性试验的讨论………………………………………………．３３ ５．５多重ＲＴ－ＰＣＲ技术的应用………………………………………………………．．３４ ５．６本试验的不足之处………………………………………………………………．３４
学雠文作者始枷嬉
签名日期：归心州月。３日
锄始膨彳八／
签名日期：∥胪钐月莎日
注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间
鸡病毒性呼吸道病原多重ＲＴ．ＰＣＲ检测方法的建立
目
摘
录
要……………………………………………………………………………………．．Ｔ
ＡＢＳＴＲＡＣＴ………………………………………………………………………………ＩＩＩ 缩略语（ＡＢＢＲＥＶＩＡＴＩＯＮ）……………………………………………………………Ｖ
ａ
ｖｅｒｙ ｃｏｍｍｏｎ
ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｖｉｒｕｓｅｓ，ｂａｃｔｅｒｉａ，ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ，ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｒｉｓｋ
ｏｒ
ｆａｃｔｏｒｓ．Ｍｏｓｔ
ｃａｓｅｓ
ｉｓ
ａ
ｍｉｘｔｕｒｅ ｏｆ ｓｅｖｅｒａｌ ｐａｔｈｏｇｐａｔｈｏｇｅｎｓ
ｈａｓ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｉｎ ｃｈｉｃｋ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ，ａｄｕｌｔ ｃｈｉｃｋｅｎ，ｅｇｇ ｄｒｏｐ ａｎｄ
摘
要
鸡的呼吸道感染在养鸡生产实践中是一类极为常见的疾病。感染病原包括病毒、 细菌、霉形体以及其它致病因素。大多数情况下是几种病原的混合感染或不同病原 先后继发感染，致使雏鸡生长发育迟缓、成年鸡产蛋下降，可引起各种日龄鸡只的
死亡。鸡新城疫（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ，ＮＤ）、鸡传染性支气管炎（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ
１．３．３禽流感病毒……………………………………………………………………９ １．４禽呼吸道疾病病原混合感染的概述……………………………………………・１０ １．４．１禽呼吸道疾病病原混合感染的传统检测方法……………………………－・１０ １．４＿２禽呼吸道疾病病原混合感染的多重ＰＣＲ检测……………………………１０ １．４．３多重ＲＴ－ＰＣＲ检测禽呼吸道疾病病原混合感染的概述……………………１０
１．１．３
ＰＣＲ技术的分类………………………………………………………………２
１．１．４多重ＰＣＲ的原理……………………………………………………………一４ １．２多重ＰＣＲ在病原检测中的应用…………………………………………………・５
１．３禽呼吸道疾病病原概述……………………………………………………………６ １．３．１新城疫病毒……………………………………………………………………・６ １．３．２鸡传染性支气管炎病毒………………………………………………………７
６
结｛仑……………………………………………………………………………………………………………．３气
参考文献…………………………………………………………………………………３ｓ 致谓ｊ－………………………………………………………………………………………………………………４１
鸡病毒性呼吸道病原多重ＲＴ．ＰＣＲ检测方法的建立
建立的每种引物均能从阳性材料中扩增出相应条带，从其它病原、阴性材料和 禽类其它呼吸道病原（鸡传染性喉气管炎、鸡毒霉形体）均无特异性扩增条带；所
华中农业大学２０１２届硕士学位论文
建立的多重ＲＴ－ＰＣＲ方法能够检测出１０ｐｇＮＤＶ、ｌｎｇＩＢＶ、１０ｐｇＡＩＶ的Ｈ５亚型、 １０ｐｇＡＩＶ的Ｈ９亚型的ＲＮＡ，证明所建立的方法特异性强，灵敏度高，可用于鸡群 临床上爆发呼吸道感染时的快速鉴别诊断。
４．２．３ ４．２．４
Ｔａｇ酶浓度的优化……………………………………………………………・２６ ｄＮＴＰ浓度的优化……………………………………………………………．２６
４．２．５退火温度的优化………………………………………………………………２７ ４．２．６多重ＰＣＲ优化的结果………………………………………………………．２８ ４．３特异性试验………………………………………………………………………．２８ ４．４敏感性试验………………………………………………………………………．２９ ４．５临床诊断…………………………………………………………………………．３０
分类号
密级
华中农业大学硕士学位论文
鸡病毒性呼吸道病原多重ＲＴ．ＰＣＲ检测方法的建立
Ａ
Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＲＴ・ＰＣＲ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｓｅｖｅｒａｌ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｖｉｒｕｓｅｓ
ｉｎ Ｃｈｉｃｋｅｎ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ
研究
生：姚蓉
指导教师：毕丁仁教授 指导小组：毕丁仁教授 石德时副教授 王喜亮副教授
型的基因片段，所扩增片段长度分别为：５２０ｂｐ（ＮＤＶ）、７４８ｂｐ（ＩＢＶ）、１５ｌｂｐ（Ｈ５）、
２６６ｂｐ（Ｈ９）。
２．４种禽类呼吸道病原多重ＲＴ－ＰＣＲ条件的优化
在普通ＲＴ－ＰＣＲ的基础上对多重ＲＴ－ＰＣＲ进行优化，分别从引物浓度比、Ｔａｑ酶
浓度、Ｍ９２＋浓度、ｄＮＴＰ浓度、退火温度这五个方面进行优化。优化的结果为Ｍ９２＋
／ｕ Ｌ（ＮＤＶ）、０．３２ ｐｍｏｌ／ｔａ Ｌ（ＩＢＶ）、０．２４ｐｍｏｌ／ｕ Ｌ（Ｈ５）、０．２４ｐｍｏｌ／ｌａ Ｌ（Ｈ９），
优化后的结果能够很好的鉴别诊断这四种病毒以及这四种病毒的混合感染。
３．４种禽类呼吸道病原多重ＲＴ－ＰＣＲ方法的建立和初步应用
李白力副教授
刘梅副教授 肖运才副教授 栗绍文副教授 孟宪荣讲师
金卉 专业：预防兽医学 获得学位名称：农学硕士 讲师
研究方向：兽医微生物与免疫学 获得学位时间：２０１２年６月
华中农业大学动物医学院 二Ｏ一二年六月
华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书
㈣Ｊ｜｜Ｊ｜ＪＪＪＩＩ㈣ＩＩｆｊＪ ＪｊＪＪＪｌＪ｜ｆＪＪＩＪ｜｜…洲
１
文献综述………………………………………………………………………………】 １．１多重ＰＣＲ技术简介………………………………………………………………．１
１．１．１
ＰＣＲ技术的概述………………………………………………………………１
１．１．２提高ＰＣＲ反应特异性方法的概述…………………………………………．．１
４．１．４普通ＰＣＲ优化结果…………………………………………………………・２３ ４．２多重ＰＣＲ体系的条件优化………………………………………………………２４
４．２．１
Ｍ９２＋浓度的优化………………………………………………………………２４
４．２．２四种引物浓度比的优化………………………………………………………２５
研究生签名：姗莞
时间：如协年秒占月渤ｊ
学位论文使用授权书
本人完金了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，为存在馆际合作关系的兄弟高校用户提供文献传递和交换服务，同时 本人保留在其他媒体发表论文的权力。 注：保密学位论文（即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文）在解密后适用于本授权书。
学位论文 是否保密
否
如需保密，解密时间
年
月
日
独创性声明
本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。
ｌａｒｙｎｇｏｔｒａｃｈｅ．
ＩＢ）以及禽流感（Ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，ＡＩ）的Ｈ５、Ｈ９亚型是一类在临床上有相似呼吸 道症状的病毒性传染病，均属于ＲＮＡ病毒，仅根据临床症状和病理表现很难准确及
时作出诊断。不同的病毒感染其后续的处置方案亦不相同，延误诊断时间或误诊均 能给养鸡企业造成重大经济损失。因此，本实验拟建立ＮＤ．ＩＢ．ＡＩＨ５．ＡＩＨ９ ４种禽类 呼吸道病原的多重ＲＴ－ＰＣＲ鉴别诊断方法，并对其特异性和敏感性进行检测，为临
２研究目的与意义……………………………………………………………………・１２ ３材料与方法…………………………………………………………………………・１３
３．１实验材料…………………………………………………………………………・１ ３ ３．１．１禽呼吸道疾病病原病毒株…………………………………………………一１３ ３．１．２主要试剂……………………………………………………………………一１３ ３．１．３主要器材……………………………………………………………………一１３ ３．１．４载体及菌株…………………………………………………………………一１４ ３．１．５试剂配制……………………………………………………………………．－１４ ３．２实验方法…………………………………………………………………………・１ ５ ３．２．１引物的设计以及合成………………………………………………………．Ｉ
ｃａｕｓｅ
ｔｈｅ ｄｅａｔｈ ｏｆ
ａ
ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ ｄａｙ—ｏｌｄ ｃｈｉｃｋｅｎｓ．Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ
４．１普通ＰＣＲ体系的初步建立………………………………………………………２２
４．１．１退化温度的优化………………………………………………………………２２ ４．１．２引物浓度优化…………………………………………………………………２２
４．１．３
ＰＣＲ产物序列的测定…………………………………………………………２３
３．２．２ １５
ＲＴ－ＰＣＲ模板的制备…………………………………………………………。１ ６
３．２．３普通ＰＣＲ体系的初步建立…………………………………………………１ ７ ３．２．４多重ＰＣＲ体系的条件优化…………………………………………………１９
华中农业大学２０１２届硕士学位论文
３．２．５特异性试验……………………………………………………………………２０ ３．２．６敏感性试验……………………………………………………………………２１ ３．２．７临床诊断………………………………………………………………………２１ ４实验结果……………………………………………………………………………一２２
关键词：多重ＲＴ－ＰＣＲ；ＮＤＶ；ＩＢＶ；ＡＩＶ－Ｈ５亚型；ＡＩＶ－Ｈ９亚型；
鸡病毒性呼吸道病原多重ＲＴ．ＰＣＲ检测方法的建立
ＡＢＳＴＲＡＣＴ
Ｃｈｉｃｋｅｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｈｉｃｋｅｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｉｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｐａｔｈｏｇｅｎ
床上提供特异性强、敏感性高且省时省力的实验室鉴别诊断方法，其主要试验结果
如下：
１．４种禽类呼吸道病原扩增引物的设计和扩增方法的建立
根据ＮＤＶ的Ｆ基因片段，ＩＢＶ的Ｎ基因片段以及ＡＩＶ的Ｈ５、Ｈ９亚型的ＨＡ 基因片段设计引物，对四对引物分别进行梯度ＲＴ－ＰＣＲ扩增，在此基础上选择合适 的ＲＴ－ＰＣＲ的退火温度同时对四对引物分别进行引物浓度的优化，确定普通ＲＴ－ＰＣＲ 的退火温度为５８℃，，引物浓度为别为０．３２ｐｍｏｌ／ｌａ Ｌ（ＮＤＶ）、０．３２ ｐｍｏｌ／ｌａ Ｌ（ＩＢＶ）、 ０．２４ｐｍｏｌ／ｐ Ｌ（Ｈ５）、０．２４ｐｍｏｌ／ｌａ Ｌ（Ｈ９）。最后设计的四对引物、优化的退火温度 和引物浓度能够通过普通ＲＴ－ＰＣＲ技术特异性扩增ＮＤＶ、ＩＢＶ、ＡＩＶ的Ｈ５、Ｈ９亚
５
讨｛仑……………………………………………………………………………………………………………．３２ ５．１多重ＲＴ－ＰＣＲ检测方法的优势…………………………………………………．．３２ ５．２多重ＲＴ－ＰＣＲ引物设计的讨论…………………………………………………．．３２ ５．３多重ＲＴ－ＰＣＲ条件优化的讨论…………………………………………………．．３３ ５．４特异性试验和敏感性试验的讨论………………………………………………．３３ ５．５多重ＲＴ－ＰＣＲ技术的应用………………………………………………………．．３４ ５．６本试验的不足之处………………………………………………………………．３４
学雠文作者始枷嬉
签名日期：归心州月。３日
锄始膨彳八／
签名日期：∥胪钐月莎日
注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间
鸡病毒性呼吸道病原多重ＲＴ．ＰＣＲ检测方法的建立
目
摘
录
要……………………………………………………………………………………．．Ｔ
ＡＢＳＴＲＡＣＴ………………………………………………………………………………ＩＩＩ 缩略语（ＡＢＢＲＥＶＩＡＴＩＯＮ）……………………………………………………………Ｖ
ａ
ｖｅｒｙ ｃｏｍｍｏｎ
ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｖｉｒｕｓｅｓ，ｂａｃｔｅｒｉａ，ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ，ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｒｉｓｋ
ｏｒ
ｆａｃｔｏｒｓ．Ｍｏｓｔ
ｃａｓｅｓ
ｉｓ
ａ
ｍｉｘｔｕｒｅ ｏｆ ｓｅｖｅｒａｌ ｐａｔｈｏｇｐａｔｈｏｇｅｎｓ
ｈａｓ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｉｎ ｃｈｉｃｋ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ，ａｄｕｌｔ ｃｈｉｃｋｅｎ，ｅｇｇ ｄｒｏｐ ａｎｄ
摘
要
鸡的呼吸道感染在养鸡生产实践中是一类极为常见的疾病。感染病原包括病毒、 细菌、霉形体以及其它致病因素。大多数情况下是几种病原的混合感染或不同病原 先后继发感染，致使雏鸡生长发育迟缓、成年鸡产蛋下降，可引起各种日龄鸡只的
死亡。鸡新城疫（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ，ＮＤ）、鸡传染性支气管炎（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ
１．３．３禽流感病毒……………………………………………………………………９ １．４禽呼吸道疾病病原混合感染的概述……………………………………………・１０ １．４．１禽呼吸道疾病病原混合感染的传统检测方法……………………………－・１０ １．４＿２禽呼吸道疾病病原混合感染的多重ＰＣＲ检测……………………………１０ １．４．３多重ＲＴ－ＰＣＲ检测禽呼吸道疾病病原混合感染的概述……………………１０
１．１．３
ＰＣＲ技术的分类………………………………………………………………２
１．１．４多重ＰＣＲ的原理……………………………………………………………一４ １．２多重ＰＣＲ在病原检测中的应用…………………………………………………・５
１．３禽呼吸道疾病病原概述……………………………………………………………６ １．３．１新城疫病毒……………………………………………………………………・６ １．３．２鸡传染性支气管炎病毒………………………………………………………７
６
结｛仑……………………………………………………………………………………………………………．３气
参考文献…………………………………………………………………………………３ｓ 致谓ｊ－………………………………………………………………………………………………………………４１
鸡病毒性呼吸道病原多重ＲＴ．ＰＣＲ检测方法的建立
建立的每种引物均能从阳性材料中扩增出相应条带，从其它病原、阴性材料和 禽类其它呼吸道病原（鸡传染性喉气管炎、鸡毒霉形体）均无特异性扩增条带；所
华中农业大学２０１２届硕士学位论文
建立的多重ＲＴ－ＰＣＲ方法能够检测出１０ｐｇＮＤＶ、ｌｎｇＩＢＶ、１０ｐｇＡＩＶ的Ｈ５亚型、 １０ｐｇＡＩＶ的Ｈ９亚型的ＲＮＡ，证明所建立的方法特异性强，灵敏度高，可用于鸡群 临床上爆发呼吸道感染时的快速鉴别诊断。
４．２．３ ４．２．４
Ｔａｇ酶浓度的优化……………………………………………………………・２６ ｄＮＴＰ浓度的优化……………………………………………………………．２６
４．２．５退火温度的优化………………………………………………………………２７ ４．２．６多重ＰＣＲ优化的结果………………………………………………………．２８ ４．３特异性试验………………………………………………………………………．２８ ４．４敏感性试验………………………………………………………………………．２９ ４．５临床诊断…………………………………………………………………………．３０
分类号
密级
华中农业大学硕士学位论文
鸡病毒性呼吸道病原多重ＲＴ．ＰＣＲ检测方法的建立
Ａ
Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＲＴ・ＰＣＲ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｓｅｖｅｒａｌ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｖｉｒｕｓｅｓ
ｉｎ Ｃｈｉｃｋｅｎ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ
研究
生：姚蓉
指导教师：毕丁仁教授 指导小组：毕丁仁教授 石德时副教授 王喜亮副教授
型的基因片段，所扩增片段长度分别为：５２０ｂｐ（ＮＤＶ）、７４８ｂｐ（ＩＢＶ）、１５ｌｂｐ（Ｈ５）、
２６６ｂｐ（Ｈ９）。
２．４种禽类呼吸道病原多重ＲＴ－ＰＣＲ条件的优化
在普通ＲＴ－ＰＣＲ的基础上对多重ＲＴ－ＰＣＲ进行优化，分别从引物浓度比、Ｔａｑ酶
浓度、Ｍ９２＋浓度、ｄＮＴＰ浓度、退火温度这五个方面进行优化。优化的结果为Ｍ９２＋