体内药物分析方法及方法的设计与评价

（一）准确度
• 准确度(accuracy)是方法评价的最基本要点之 一，它是表示测定结果与真值的符合程度。常 用 回 收 率 (recovery) 数 值 反 映 测 定 的 准 确 程 度，也可通过与其他已建立的方法进行比较的 办法来加以反映。
• 将已知量的药物纯品加到空白样品(如血样)中 去，经过一系列的处理、测定，所得药物量与 加入量之比值的百分率即为回收率。
3、荧光分光光度法
• 荧光分光光度法的灵敏度比紫外-可见分光光 度法的灵敏度高，最高可达到10-12g/mL，虽 然有荧光的物质数量不多 现象。由于荧光衍生物试剂的使用，进一步扩 大了荧光分光光度法的应用，因此该法在体内 药物分析和药物动力学研究中得到广泛的应 用。
（二）免疫分析法
• 免疫分析主要指放射免疫、酶免疫、荧光免疫 分析等。该法的原理是利用抗原-抗体特异反 应来测定体内药物的含量。该法具有灵敏度 高、专一性强、操作简便、快速等优点，是临 床治疗药浓监测和生化检验的常用方法，但需 要一定的试剂盒和仪器。
(三)色谱分析法
• 色谱方法包括HPLC、GC和TLC等方法。色谱 法在我国体内药物分析中的应用始于20世纪80 年代，由于色谱法具有分离分析功能，具有高 的专属性和灵敏度，并能同时分离分析结构相 似的药物和代谢物等优点，使得其近20年来发 展迅速，尤其是HPLC法，己在体内药物分析 领域中确立了主导地位，常用作体内药物分析 中评价其他方法的参比方法。近年手性色谱技 术、毛细管电泳技术、色谱与光谱联用技术、 色谱与免疫联用技术等的建立与发展，更为色 谱技术在体内药物分析中的应用增添了无量的 前景。
• 回收率当然越接近100％越好，但因样品组分 复杂，含量低，处理步骤多时就很难达到高的 回收率。对于一个方法来说，更为重要的是每 次测定所得回收率要保持恒定，虽然有时回收 率较低，但只要重现性好，通过校正后仍可采 用。根据回收率测定方法不同可分为绝对回收 率和方法回收率。
1．绝对回收率
• 绝对回收率也称萃取回收率、提取回收率，它 反映了一个方法的萃取效率，与体内样品检测 灵敏度有关，是评价体内药物分析方法的重要 指标之一。
• 由于光谱法不具备分离功能，选择性较差，因 此对样品的预处理要求较高。选用专属的方法 或试剂与之反应，测定衍生物的荧光或对光吸 收强度，也可借助数学的方法消除干扰。
1、比色法
• 比色法灵敏度不高，通常只能测定出1ug/ml浓 度以上的样品。但该法具有快速，简便，对仪 器要求不高等特点。只要采用具有选择性的显 色剂和反应条件，可不经分离提取等步骤，直 接用于血药浓度监测。
方法的评价
• 对于所建立的体内药物分析方法的可行性与可 靠性，需要应用若干标准来进行方法学的考察 与评价。这是研究和建立一个新的分析方法时 必须着重抓住的几个环节。
• 评价一个体内药物分析方法的优劣主要有以下 几个指标：精密度、准确度、灵敏度、专属性 或选择性、可测浓度范围、测定所需时间以及 对生物样品的适应性等，现择要讨论如下：
• 在内标法中，应注意药物与内标准物质各自用 外标法测得的绝对回收率应相近，两者相差应 小于10％，否则回收率偏离100％太远。
2．方法回收率
• 取一系列浓度的药物标准品加到空白体液中， 按设定方法测定，根据标准品浓度及响应的测 定信号值绘制标准曲线，先按最小二乘法求出 回归方程。然后取高、中、低浓度的药物标准 品添加到空白体液中，每个浓度至少平行测定 5份，按标准曲线制备方法同法测定，所得信 号值代入回归方程，求得测定值。最后与加入 量比较，得方法回收率。除定量限外，各浓度 点测得的平均值偏离实际加入量应小于15％， 定量限这一点应小于20％。
体内药物分析
Biopharmaceutical Analysis
体内药物分析方法及方法的设计与评价
• 生物样本经预处理后，选用适当方法进行测 定。可供生物体液中药物及其代谢物含量测定 的分析方法很多，归纳起来主要有三类：
（一）光谱分析法 （二）免疫分析法 （三）色谱分析法
• 除以上三类主要方法外，在生物药物分析中有 时还使用同位素标记药物，它们主要应用于 RIA、同位素逆稀释分析，或作为GC-MS分 析的内标，以及在药物分离中作示踪应用等。
(三)明确测定的目的、要求
• 应了解拟建立的方法是用于测定药代动力学参 数，还是用于临床药浓监测。前者要求具有一 定的灵敏度和准确度，不强调简便、快速，设 计方法时应考虑到不同时间获得的样品中药物 浓度变化较大这一因素。而用于临床药浓监 测，则要求方法简便、快速。另外，是否要求 同时测定母体药物和代谢物，若需同时测定两 者，则应选择具有分离能力或专属的测定方 法。
• 选用何种方法进行体内药物分析为好呢？一般 要根据药物的理化性质、结构持征、药物浓度 大小、干扰成分的多少、预处理方法、实验目 的以及实验室条件等因素综合起来进行考虑。
分析方法的设定依据
(一)做好文献总结、整理工作 • 对已有报道的药物进行测定，应系统总结前人
的文献，从中找出哪些问题已解决，还存在哪 些问题等。对尚无文献报道的，也可根据药物 的性质情况，参考相似类型药物的文献资料。
• 在色谱分析中常采用内标法测定含量，将药物 标准品和内标准物质加到空白血样中，按规定 方法处理，测得药物和内标峰面积，求出它们 的比值R测＝A药/A内。另取相同浓度的药物标 准品和内标准物质的纯溶剂溶液进样，得药物 标准品和内标峰面积，计算两者的比值R真＝ A'药/A'内。再根据下式求出回收率：
• 此外，还有一些含抗生素类药物的生物样品， 它们可用微生物方法测定，利用抗生素在琼脂 培养基内的扩散作用，比较样品与药物标准品 两者对接种的试验菌产生的抑菌圈的大小，借 以测定样品内抗生素药物的浓度。
（一） 光谱分析法
• 光谱分析法包括比色测定、紫外分光光度法和 荧光分光光度法。光谱法在体内药物分析中是 应用较早的方法之一，根据陆明廉对我国 1975～1984年间血药浓度测定方法的统计，应 用光谱法占应用血药分析方法总数的三分之 一。虽然近十多年来色谱法的飞速发展，使光 谱法退出了体内药物分析应用方法的主角地 位，但因其操作简便、快速，在体内药物分析 中仍占有一定的地位。
（四）毛细管电泳法
• 毛细管电泳法(CE)，又称高效毛细管电泳法 (HPCE)，是20世纪末发展起来的一种高效、 快速的分析技术。HPCE是以高电压电场为驱 动力，以毛细管为分离通道，依据样品各组分 之间淌度和分配系数的不同而实现分离的一类 液相分离技术。
• 近年来HPCE发展十分迅速，已在化学、生命 科学和药学等领域得到广泛的应用。
• 现以色谱法为例，说明绝对回收率的求算过 程。
• 例如取一定量被测药物标准品，加到空白血 样中，按规定方法处理，使最后溶液中药物 标准品浓度为1ug/mL，测定色谱峰面积，记 为A测，另取1ug/mL的药物标准品的纯溶剂溶 液宜接进样，测得色谱峰面积记为A真，用外 标法计算。
• 绝对回收率应考察高、中、低3个浓度，低浓 度选择在定量限(LOQ)附近，高浓度在标准曲 线的上限附近，中间选一个浓度。对于回收率 的大小与变异不宜苛求，一般添加量在10-6～ 10-9级，绝对回收率若能达到50％～80％，应 认为是令人满意的。
(五)体内实际样品测定
• 经过上述(一)至(四)步骤后进行实际样品的测定。 但要指出的是，以上步骤只是生物样品实样检测 前的准备工作，不能完全确定是否适用于实样测 定。因药物在体内变化是复杂的，如不注意药物 代谢和蛋白结合情况，则应用体外建立的方法， 进行体内实样测定时往往会失败，甚至导致错误 的结论，所以在设计方法时强调对药物体内过程 要有一定程度的了解，从而选择避免干扰和适合 样品实际情况的方法。有时也可采用专属性强， 已证明用于体内实样测定的步骤和方法作为对照 测定，以此来检验所建立的方法的实际可行性。
1、HPLC法
• HPLC法在体内药物分析中的应用已大大超过 其他分析方法，成为体内药物分析中应用最广 泛的技术之一。与GC法相比，它具有以下优 点：
• (1)适用范围广，可在室温下进行检测。对于 挥发性低的，热稳定性差的，分子量大的以及 离子型化合物等均可测定。
• (2)样品预处理简单，可不经萃取和衍生化处 理直接测定极性大的水溶性药物，特别适合生 物样品的测定；
• (3)分离效率高，流动相选择范围广，仪器自 动化程度高。
• (4)检测器多是针对整分子的光谱特征进行检 测的，专一性较高。检测方法多采用非破坏性 的。流出组分可回收，可用于样品的制备。
2、GC法
• GC法是最先兴起的具有分离和分析两种功能的 测定技术，在药物分析和体内药物分析中曾得到 较广泛的应用。由于HPLC法的发展，尤其是 RP-HPLC(反相-高效液相色谱法）的广泛应用， 使GC法的应用相对减少。其原因是GC法本身具 有一些缺点，应用时常受被测组分的挥发性和热 稳定性等方面的限制。用GC测定药物时一般需 要在120℃以上柱温条件下进行，因此不适合用 于遇热不稳定和极性大或挥发性差的药物，不适 合用于生物样品的测定。因而影响该法在体内药 物分析中的广泛应用。
(三)以水代替空白样品，添加标准后测定
• 以水代替空白生物样品，添加标准后按拟定的 方法进行测定，以了解提取回收率及最低检测 浓度的大致情况，从而对萃取溶剂、pH值、 挥发浓缩等条件进行选择。
(四)空白样品中添加标准后测定
• 于空白生物样品中添加一定量标准品后按拟定 方法进行测定，求得样品回收率数据，建立标 准曲线。若采用色谱法测定，多数情况下需要 用内标法定量，则应首先选择合适的内标，然 后进行回收率的测定。
• 由于该法具有高效、快速、灵敏、进样少、信 息量大、运行成本低、易于自动化等优点。因 此使其在体内药物分析及其代谢的检测中得到 广泛的应用。
• 根据HPCE法的分离模式的不同。HPCE又分 为：毛细管区带电泳、胶束电动毛细管色谱、 毛细管凝胶电泳、毛细管等电聚焦、毛细管等 速电泳和毛细管电色谱法。上述这些方法近几 年来在体内药物分析中均得到不同程度应用。
(二)充分了解待测药物的特性与体内状况
• 药物的理化性质和体内过程是建立方法的主要 依据。药物的理化性质包括酸碱性(pKa)、亲 脂性、溶解度、极性、光谱特征、稳定性等， 这些性质与分析方法的选择、实验条件的改善 密切相关。与常规分析方法不同，体内药物分 析的对象是来自生物体内的样品，因此对药物 在体内的状况必须了解，如药动学参数、体内 代谢情况等。这涉及样品取样频率与间隔，分 析方法的选择等。
(二)空白样品测定
• 取空白生物样品，按拟定的方法进行处理，测 定空白值(或色谱图)。空白值高低或色谱图状 况将影响到方法的灵敏度和专属性，应力求将 空白值降低。在色谱分析中应力求减少体内样 品中内源性杂质峰，对无法消除的内源性杂质 峰应设法使其从待测物的色谱区域内移开。能 否取得良好的样品空白实验结果，是决定测定 方法实际可行性的重要环节，必须设法解决。
2、紫外分光光度法
• 分光光度法的灵敏度较比色法高，适用于测定 具有紫外吸收的药物，方法简单，仪器要求也 不高。但用于测定含药浓度低的样品时，也受 到一定的限制。如测定体液中药物浓度时，亦 可能受体液中内源性杂质的干扰和影响。因 此，本法在体内药物分析中也受到灵敏度和专 一性的限制。但采用一些光谱分析技术，如用 差示分光光度法，导数分光光度法，双波长和 三波长分光光度法等，可适当提高方法的灵敏 度和选择性，也可消除杂质的干扰，因此，该 法目前仍用于一些生物样品中的药物检测。
（四）结合实验室条件
• 根据实验室现有的和可能获得的设备条件加以 考虑，选择可行的方法。
方法建立的一般实验步骤
• 方法初步拟定后，还需进行一系列实验工作， 以选择最佳实验条件及验证所拟定的方法是否 适合实样检测。通常包括下列步骤：
（一）以纯品进行测定 • 取药物或其代谢物纯品适量，按拟定方法测
定，求得浓度与测定响应值之间的关系，进行 线性范围、最适测定浓度、检测灵敏度、测定 最适条件(如pH值、温度、反应时间等）等的 选择。