实验步骤方法

第一章 DNA及RNA实验
第一节组织和细胞RNA的制备
1、样品处理：
（1）培养细胞：悬浮细胞：收获细胞2-4×106，移入1.5ml离心管中，加入1mlTrizol，混匀，室温静置5min。

（2）贴壁细胞：将细胞弃去培养基，用冰浴的PBS洗涤一次，之后在培养皿中加入Trizol （以一个80-90%融合度的6cm培养皿加入1ml的Trizol为准），用枪吹打贴壁的细胞，待细胞完全吹打下来，转入1.5ml离心管中。

（3）组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃ 及液氮中保存的均可）置1.5ml离心管中，加入1mlTrizol充分匀浆，室温静置5min。

2、加入0.2ml氯仿，震荡15s，静置2min，4℃离心，12000rpm×15min，取上清。

3、加入0.5ml异丙醇(或与上清等体积），将管中液体轻轻混匀，静置10min，4℃离心，12000rpm×10min，弃上清。

4、加入1ml75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。

4℃，7500 rpm×5min，弃上清。

5、重复用乙醇洗涤一次。

6、在室温中放置10min晾干，20-30ul加入适量的DEPC水溶解（65℃促溶10-15min）
注意事项：
1、细胞量和Trizol的加入量一定要按步骤1的比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会是内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。

2、在细胞加入Trizol裂解后，如近期不需要使用RNA，可将Trizol裂解的细胞暂存于-80℃中。

3、实验过程必须严格防止RNase的污染。

提取RNA所使用的镊子、饭盒等需要经过高温烘烤后才可使用；RNA提取所使用的枪头、EP管均均为RNA提取专用，普通枪头及EP管需要用DEPC浸泡、消毒后使用。

4、要避免沉淀完全干燥，否则RNA难以溶解。

试剂制备：
75%乙醇（DEPC配制）：
DEPC水：
第二节逆转录PCR
【使用Fermentas ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kit】
1、取RNase-free的0.2微量离心管，冰上依次加入下列试剂的混合物至管中：
试剂体积（μl）
总RNA（0.1-5ug）X
Oligo(dT)18 primer （0.5 μg/μl） 1.0
RNA-free H2O Y
X+Y=11 μl，温和混匀，65℃孵育5 min后迅速置于冰上。

5× rea ction buffer 4.0
10 mM dNTP Mix 2.0
RiboLockTM Ribonuclease Inhibitor （20 U/μl） 1.0
RevertAid TM M-MuLV ReverseTranscriptase （200 U/μl） 1.0
温和混匀，42 ℃反应60 min，70 ℃孵育10 min终止反应，冰上冷却。

注意事项
1、在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNAde完整性。

2、实验中所有物品都应避免RNA酶的污染。

操作过程中均应戴手套。

第三节引物设计
一、引物设计总体原则：
1、配对引物区长度约20-24bp，GC含量比40-60%，尽量无多个连续的核苷酸序列（大于4个）；
2、引物的3’端不能被封闭，3’端无较长的自身发卡结构（大于2个）；
3、引物总长度最好不要超过40bp，特殊引物除外；
二、基因克隆引物的设计：
1、引物设计使用Primer Premier 5.0软件(简称PP 5.0)进行；
2、首先将克隆的基因序列拷贝至PP 5.0软件中，保证所克隆基因的起始密码子位于30bp之后（即31bp开始为ATG。

），基因的末端保证在终止密码子之后依然有超过20bp 的延伸序列；
3、点击Enzyme选项进行酶切分析，找到不能切割序列的酶（Non-cutters），从中选择较为常用的两个酶（如Hind3、EcoR1、Xho1、BamH1和Kpn1等）进行克隆，同时注意此酶必须在目的载体的多克隆序列内；
4、点击“primer”进行引物设计，先设计正向引物，将“S/A”选钮点至“S”，将引物序列固定至所需要克隆的起始端，点击“edit primers”，减去数个碱基后点击“prime”进行引物分析，观察引物的Tm值（60-70℃）、GC比例（40-60%），尽量符合此条件；
5、在5’端加上酶切序列，在酶切序列和配对序列之间斟情加减碱基以防止错码，在酶切序列之前添加3个保护碱基，保护碱基的序列可参考“NEB限制性内切酶保护碱基表”或以个人习惯而定，最后将序列拷贝出；
6、反向引物设计时，先将“S/A”点至“A”，同理进行设计，注意反向引物如果后续有标签序列，不能将终止密码子设计入引物中；
三、普通PCR引物设计：
普通PCR引物长度在18-22bp之间，引物需要跨内含子（即不同引物需要在不同的外显子之上），GC比例在40-60%之间，利用PP5.0分析上下游引物的退火温度在55-60℃左右，所PCR产物长度在100-250bp之间。

第四节目的基因基因克隆及PCR
一、实验原理
PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成.由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106 倍。

二、主要成分
1. 引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。

引物的好坏往往是PCR成败的关键。

2. 4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)：dNTP应用NaOH 将pH调至7.0，并用分光光度计测定其准确浓度。

dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装，-20℃贮存。

一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L。

理论上4 种 dNTP各20μmol/L，足以在100μl反应中合成2.6μg 的DNA。

当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性。

3．Mg2+：Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。

通常Mg2+ 浓度范围为0.5-2mmol/L。

对于一种新的PCR反应，可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+ 进行预备实验，选出最适的Mg2+浓度。

在PCR反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团，例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+ 离子浓度的物质,以保证最适Mg2+ 浓度。

4. 模板：PCR反应必须以DNA为模板进行扩增，模板DNA可以是单链分子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好).就模板DNA而言,影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。

5. Taq DNA聚合酶：一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5℃ 130min，95℃ 40min，97℃ 5mi n。

6. 反应缓冲液：反应缓冲液一般含10-50mmol/L Tris·Cl (20℃下pH8.3-8.8)，50mmol/L KCl和适当浓度的Mg2+。

Tris·Cl在20℃时pH为8.3-8.8，但在实际PCR反应中,pH为6.8-
7.
8. 50mmol/L的KCl有利于引物的退火。

另外，反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100μg/ml的牛血清白蛋白(BSA),它们可稳定酶活性，另外加入T4噬菌体的基因32蛋白则对扩增较长的DNA片段有利.各种Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。

三、操作步骤
1. 在冰浴中，将以下各成分加入一无菌0.2ml离心管中。

10×Pfu Buffer5ul
10×LA
Buffer
5ul
dNTP(2mM) 4ul dNTP(2mM) 10ul 模板1ul 模板1ul
上游引物1ul 上游引物1ul
下游引物1ul 下游引物1ul Pfu酶0.5ul Pfu酶0.5ul ddH2O 37.5ul ddH2O 31.5ul 总体积50ul 总体积50ul
2. 调整好反应程序。

将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。

一般：在93℃ 预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 30s→58℃ 30s→72℃ 30s，循环30次，最后在72℃保温7min。

3. 结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。

4. PCR的电泳检测：取PCR产物加6×上样缓冲液，电泳检测。

四、注意事项
1. PCR非常灵敏, 操作应尽可能在无菌操作台中进行。

2. 吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂。

3. 加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。

4. 应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。

5.如果使用质粒或纯化好的DNA片段当模板，模板量应在10-50ng内。

第五节胶回收
1、使用TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。

2、在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。

3、称量胶块重量，切碎胶块，按1mg：1ul的比例加入Binding Buffer
4、均匀混合后，60℃加热直至胶块融化，此时应间断振荡混合，可使胶块充分融化
5、胶融化后，待恢复至室温，将胶块融化液加入到Column中，静置2-3min，12000rpm 离心1min
6、将Collection Tube中的胶块融化液倒入Column中， 12000rpm 1min再离心一次，以提高回收率
7、弃滤液，加入650ulWashing Buffer，12000rpm离心1min
8、弃滤液，再加入650ulWashing Buffer，12000rpm离心1min
9、弃滤液，12000rpm开盖空离2min，Column放置于新的1.5ml的离心管上，在Column 膜中央处加入30-50ul的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置3min。

（注：把灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率）
10、12000rpm离心1min
第六节酶切
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。

1.将以下各成分加入一无菌0.2ml离心管中。

内切酶Buffer 3ul 内切酶Buffer 2ul
内切酶I 1ul 内切酶I 1ul
内切酶II 1ul 内切酶II 1ul
待切DNA片段2ug 待切质粒2ug
ddH2O 加水至30ul ddH2O 加水至20ul 总体积30ul 总体积20ul
2. 混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上），置于37℃ 酶切1h以上，使酶切反应完全，80℃ 5min使酶失活。

3.电泳检测
第七节连接及转化
1、取新的经灭菌处理的0.2ml eppendorf管, 编号。

2、将10-100ng酶切后回收的载体DNA转移到无菌离心管中，加3-10倍摩尔量的外源DNA片段。

3、加入10×T4 DNA ligase buffer 1μl, T4 DNA ligase 0.5μl, 加蒸馏水至体积为10μl,混匀后用微量离心机将液体全部甩到管底,于室温（20-25℃）孵育2小时。

4、取分装好的100ul感受态菌，置于冰上，待化开后无菌操作加入10ul连接产物，轻柔混匀，冰浴30min
5、42℃热激90s，紧接着继续冰浴3min，无菌条件下加入300ul LB液体培养基，混匀，置于37℃摇床45min
6、4000rpm，2min离心菌体，弃去上清液200μl，将菌体沉淀吹打重悬并用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上，37℃下培养半小时以上，直至液体被完全吸收。

倒置平板于37℃继续培养12-16小时，待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板。

7、用无菌枪头挑取白色单菌落接种于含Amp 50μg/ml的 5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时。

注意事项
1、DNA连接酶用量与DNA片段的性质有关，连接平齐末端，必须加大酶量，一般使用连接粘性末端酶量的10-100倍。

2、连接反应后，反应液在0℃储存数天，-80℃储存2个月，但是在-20℃冰冻保存将会降低转化效率。

第八节感受态的制备
1、从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中
2、37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。

将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。

(注：以下操作均应在冰浴中进行。

)
3、将培养液50ml分装入50ml离心管中。

4℃离心，4000rpm 10min，弃去上清。

4、用冰浴的0.1M MgCl2 20ml 悬浮30min
5、4℃离心，4000rpm 10min，弃上清，加入冰浴的0.1M CaCl2－甘油1ml悬浮，按100ul/管分装到1.5ml离心管中。

6、-70℃保存
质粒抽提
1、用1.5ml离心管收集1-5ml菌液，12000rpm离心1min，弃上清
2、加入250ul溶液I/RNase A混合液，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮。

室温静置1-2min。

（初次使用试剂盒时，请将RNase A全部加入到溶液I中，均匀混合后于4℃保存）
3、加入250ul溶液II，轻柔地反复颠倒混匀5-6次。

室温静置1-2min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。

（注：若溶液II出现沉淀，清于37℃保温溶解，待恢复至室温后使用；不可剧烈混合，否则会使染色体DNA断裂；此步骤不宜超过5min）
4、加入350ul溶液III，立即轻柔地反复颠倒混匀5-6次。

此时会出现白色絮状沉淀。

5、 12000rpm室温离心10min，收集上清。

6、将上清置于DNA纯化柱中，静置1-2min。

（如果收集的上清液过多，超过DNA纯化柱容积800ul，可将上清分次加入DNA纯化柱中）
7、加入500ul溶液Washing Buffer，12000rpm离心1min，弃滤液
8、加入500ul溶液Washing Buffer，12000rpm离心1min，弃滤液
9、 12000rpm离心3min，以彻底除去纯化柱中残留的液体
10、将ＤＮＡ纯化柱置于新的离心管中，向纯化柱中央膜处，悬空滴加30-100ulElution Buffer，室温放置2min，-20℃保存
第二章蛋白质实验
第一章 Western blot
一、蛋白的提取及样品的制备
（一）组织蛋白的提取及样品制备：
1、从-80℃取出组织，融化后每100mg组织加入1ml蛋白裂解液，用剪刀剪碎，放置冰上裂解10min；
2、冰上匀浆器匀浆，冰浴静置30min后移置EP管中；
3、4℃，14000g离心15min，取上清；
4、测定蛋白浓度，调整分装后按照2×上样缓冲液：蛋白裂解液：DTT=5:4:1加入，煮沸5-10min，4℃，取出立即插入冰中冷却，然后12000g离心10min，取上清保存于-80℃，临用时取出煮沸3min后上样。

（二）细胞蛋白的提取及样品制备：
1、细胞予0.01MPBS洗涤2次；
2、加入1mlPBS后，细胞刮轻轻刮取细胞，移至1.5ml离心管中，1000g*5min离心收集细胞；
3、加入配置好的蛋白裂解液加入细胞沉淀中，冰上裂解10min；
4、12000g，5min离心收集蛋白上清，测定蛋白浓度；
5、调整分装后按照4×上样缓冲液：蛋白裂解液：DTT=5:4:1加入；也可以配置2×上样缓冲液，按照4×上样缓冲液：蛋白裂解液：DTT=2.5:6.5:1加入；
6、煮沸10~15min，4℃，12000g，10min离心，取上清保存于-80℃，用时取出煮沸3min后上样。

（三）分泌蛋白的提取及样品制备：
直接收集分泌液，照2×SDS loading buffer：细胞培养上清：DTT=5:4:1加入后煮沸。

二、SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
1、装好架子，检查是否漏水；按照配方配制分离胶（下层胶），在胶上面加入一层异丙醇或蒸馏水，使胶平整，室温聚合30min左右；
2、洗去异丙醇（直到没有气味），配制浓缩胶，迅速搅拌后加入，加入时注意不要有气泡，室温聚合20min；
3、上样，电泳：上层胶用60-80V电压，当样品至分离胶时，用100-120V或者130V电压；对小分子量的蛋白检测（<100KDa）也可以采用120V电压，不需要换电压。

一般电泳时间在1.5小时左右。

三、转膜
1、电泳结束后，将胶剥出，切除上层胶和部分下层胶，置于转膜缓冲液中平衡15min；
2、准备PVDF膜，在甲醇中透明1min，dH2O中洗去甲醇，膜停止转动后放置于转膜缓冲液中平衡15min；
3、切取与胶-膜大小相似的滤纸，置于转膜缓冲液中平衡15min；
4、准备冰盒，将转膜槽放入其中；
5、从正极到负极（黑→白）依次放好海绵垫、滤纸、胶条、PVDF膜、滤纸和海绵垫（注意胶和膜间不要有气泡）；
6、装好电转移仪，300mA转移2h，板中出现由下向上溢出的气泡后向冰盒中加入冰块。

【注意】1）滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸>=胶>=膜；2）滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路；3）膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿。

而且在以后的操作中，膜也必须随时保持湿润。

四、封闭：封闭缓冲液4°C封闭过夜或者室温放入摇床2小时。

五、抗体孵育
1、将稀释好的抗体和膜一起孵育，一般采用4°C过夜或者室温2-3小时，可根据抗体量和膜上抗原量适当延长或缩短时间；（抗体一般用牛奶稀释，注意封膜时不要有气泡，否则气泡处的膜与抗体接触不完全）
2、TBST洗5 min×3-5次；
3、二抗孵育，室温2 h；
4、TBST洗5 min×3-5次。

六、显影
1、ECL显影，冲洗胶片；
2、Oderssay扫膜，并保存。

七、试验中所用到的试剂和缓冲溶液
30% 丙烯酰胺
丙烯酰胺29.2g
双丙烯酰胺 0.8g
dH2O 定容至100ml
2×分离胶缓冲液
Tris base 9.075 g
SDS 0.2g
调节pH=8.8 dH2O定容至100ml
2×储备胶缓冲液
Tris base 3.025g
SDS 200mg
调节pH=6.8 dH2O定容至100ml
10%过硫酸铵
过硫酸铵100mg
dH2O 1ml
4×上样缓冲液
1M Tris-Cl（pH 6.8）20ml
甘油40ml
SDS 8g
溴酚蓝 1g
dH2O 定容至100ml
2×上样缓冲液
1M Tris-Cl（pH 6.8）10ml
甘油20ml
10%SDS 40ml
溴酚蓝 0.5g
dH2O 定容至100ml
10×电泳缓冲液
Tris 30.2g
甘氨酸188g
SDS 10g
dH2O 定容至1000ml
（使用时10×电泳缓冲液与dH2O以1:9稀释）
电泳缓冲液
Tris 3.02g
甘氨酸18.8g
10%SDS 10ml
dH2O 定容至1000ml
10×转膜缓冲液
Tris 3.03g
甘氨酸14.4g
dH2O 定容至1000ml
（使用时10×转膜缓冲液与甲醇及dH2O以1:2:7稀释）
转膜缓冲液
Tris 3.03g
甘氨酸14.4g
甲醇200ml
dH2O 定容至1000ml
10×TBST缓冲液
Tris 24.2g
NaCl 80g
dH2O 定容至1000 ml
（使用时10×TBST缓冲液与dH2O以1:9稀释，并加入0.5ml Tween 20）
TBST缓冲液
Tris 2.42g
NaCl 8g
Tween 20 0.5ml
dH2O 定容至1000 ml
5%封闭缓冲液
脱脂奶粉 5g
TBST缓冲液100ml
考马斯亮蓝R-250染色液
考马斯亮蓝R-250 1g
异丙醇250ml
乙酸100ml
dH2O 定容至1000ml
考马斯亮蓝染色脱色液
乙酸100ml
乙醇 50ml
dH2O 400ml
丽春红染色液
丽春红0.5g
乙酸1ml
dH2O 定容至100ml
分离胶配方（10ml）
6% 8% 10% 12% 15% H2O 2.9ml 2.2ml 1.6ml 0.9ml 0ml 30% 丙烯酰胺 2.0ml 2.7ml 3.3ml 4.0ml 5.0ml 2×分离胶缓冲液 5.0ml 5.0ml 5.0ml 5.0ml 5.0ml 10%过硫酸铵0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml TEMED 8μl 6μl 4μl 4μl 4μl 浓缩胶配方（4ml）
H2O 1.5ml
30% 丙烯酰胺0.5ml
2×分离胶缓冲液 2.0ml
10%过硫酸铵0.04ml TEMED 4 l
免疫组化
一、切片准备：
1、石蜡切片：组织切片在60 ℃恒温箱中烘烤6-8 h，如果不是连续烤片，浸二甲苯前应在60 ℃烤0.5-1 h。

（1）脱蜡：组织切片置于二甲苯中浸泡15分钟,更换二甲苯后再浸泡15分钟
（2）水化：分别过无水乙醇→95%乙醇→80%乙醇→70%乙醇→自来水→ddH2O
冰冻切片：将切片放在37 ℃烘烤1 h，然后置于组化PBS中浸泡，易脱片，一般不用高温修复
2、抗原热修复
a 高压热修复先将高压锅中水煮沸，在瓷缸中加入0.01 M枸橼酸钠缓冲溶液（pH 6.0），将玻片置于金属染色架上放入瓷缸内后置于高压锅中，盖上不锈钢锅盖，缓慢加压，待小阀门升起来后，继续加热3分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。

此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。

b 沸热修复电炉或水浴锅加热0.01 M的枸橼酸钠缓冲液（pH 6.0）至95 ℃左右，放入组织切片加热10-15分钟。

3、自然冷却至室温，然后用PBST冲洗，涂指甲油或唇膏，此过程不要干片
4,,3%过氧化氢除去酶？
一、Dako试剂盒（仅适用于一抗为鼠和兔来源的分子）
4、滴加一抗，（1：50,1:100,1:200）一抗稀释液稀释（绿色），室温静置1 h，或者4度过夜，PBST洗3次各5分钟，注意一抗种属，
5、滴加二抗（A），室温静置半小时，PBST洗3次各5分钟
6、 DAB(浓缩液：稀释液=1:20，有毒)显色5分钟，自来水冲洗5分钟
7、苏木精复染（染细胞核），盐酸乙醇分色，自来水冲洗5分钟
8、脱水、透明、封片、镜检。

脱水：70%乙醇3分钟，80%乙醇3分钟，95%乙醇5分钟，无水乙醇5分钟，然后取出室温晾干透明：二甲苯各8分钟
封片：中性树胶
通用二步法：PV-9001（适用于鼠抗及兔抗），PV-9003（适用于羊抗）
脱蜡水化及抗原修复步骤同前
冷却后，PBST洗3次每次5分钟，然后用3% H2O2去除内源性过氧化物酶，37 ℃孵育40 min，PBST洗3次每次5分钟
涂指甲油或唇膏，滴加一抗，室温静置1小时或4℃过夜（4 ℃过夜后需37 ℃复温45分钟），PBST洗3次每次5分钟
滴加二抗试剂一（黄色），37 ℃20分钟，PBST洗3次各5分钟
滴加二抗试剂二（红色），37 ℃半小时，PBST洗3次各5分钟
DAB显色5分钟，自来水冲洗5分钟
苏木精复染，盐酸乙醇分色，自来水冲洗5分钟
脱水、透明、封片、镜检。

生物素放大法
脱蜡水化及抗原修复同前
冷却后，PBST洗3次每次5分钟，然后用3% H2O2去除内源性过氧化物酶，37 ℃孵育40 min，PBST洗3次每次5分钟
涂指甲油或唇膏，封闭液封闭，室温2 h，
滴加一抗，室温2 h，4 ℃过夜，PBST洗3次每次5分钟
滴加生物素标记的二抗，PBS稀释，1:1000，室温2 h，PBST洗3次每次5分钟
滴加生物素放大用AB液，PBS稀释，37 ℃ 40 min，PBST洗3次每次5分钟
DAB显色5分钟，自来水冲洗5分钟
苏木精复染，盐酸乙醇分化，自来水冲洗5分钟
脱水、透明、封片、镜检。

试剂配制
组化PBS(0.01 M)
Na2HPO4·12H2O 3.23 g
NaH2PO4·2H2O 0.45 g
NaCl 8.00 g
ddH2O 至1000 ml
70%乙醇：368 ml 95%乙醇加ddH2O稀释到500 ml
80%乙醇：421 ml 95%乙醇加ddH2O稀释到500 ml
枸橼酸钠缓冲溶液：一小袋用2000 ml ddH2O溶解
3% H2O2：30% H2O2：甲醇=1:9
封闭液：
10%驴血清 0.3 ml
0.3% BSA 90 mg
0.1% triton X-100 3 μL
0.05% Tween-20 1.5 μL
0.01M PBS 2.7 ml
DAB：试剂C：试剂B=1:50
盐酸乙醇：浓盐酸：70%乙醇=1 ml:500 ml
注意事项：
二甲苯在烘箱中加热时必须将鼓风关掉，防止二甲苯挥发溢出。

切片放入二甲苯及换缸时必须在通风橱中进行，然后再拿到烤箱中。

夏季二甲苯可不加热。

考片温度不要超过62度
抗原修复后，切片不能直接放到冷水中，要在修复液中冷却到室温。

缸子外面可放冰块以加速冷却。

抗原修复后一定不要干片，否则容易产生非特异性着色
DAB显色后直接将切片放入自来水中，以免弄到湿盒内造成污染。

二甲苯更换时直接倒在通风橱内的空瓶子中，可用卷纸将缸内蜡渍擦净，然后倒入新的二甲苯
封片脱水时从无水乙醇中拿出后必须晾干，才能放入二甲苯中。

而在二甲苯中浸泡到时间不要干片，滴加中性树脂盖盖玻片
脱蜡和透明的二甲苯不可混用
免疫组化问题解答
1、染色过强
a 抗体浓度过高或孵育时间过长降低抗体滴度、抗体孵育时间：室温1小时或4度过夜
b 孵育温度过高超过37度一般在室温20-28度
2、非特异性背景染色
a 操作过程中冲洗不充分每步冲洗3次每次5分钟
b 组织中含过氧化物酶未阻断可再配置新鲜3% H
2O
2
封闭孵育时间延长
c 组织中含内原性生物素正常非免疫动物血清再封闭
d 血清蛋白封闭不充分延长血清蛋白封闭时间
3、染色弱
a 抗体浓度过低、孵育时间过短提高抗体浓度、孵育时间不能少于60分钟
b 试剂超过有效使用时间应更换试剂
c 操作中添加试剂时缓冲液未沥干每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液
使试剂稀释（应防止切片干燥）
d 室温太低低于15度要改放在37度孵育箱孵育30-60分钟或4 度冰箱过夜
e 蛋白封闭过度封闭不要超过12分钟
4、染色阴性
a 操作步骤错误应重试设阳性对照
b 组织中无抗原设阳性对照以验证试验结果
c 一抗与二抗种属连接错误仔细确定一抗二抗种属无误。

免疫荧光
细胞荧光：
1.种植细胞到小圆片上，37 ℃孵育过夜
2.刺激细胞
3.固定：到达合适时间的细胞孔，弃掉原来的培养基，细胞用PBS洗一下，加
入4%多聚甲醛固定，每孔300 μL，室温40 min或4 ℃ 1 h，PBS洗，10分3次
4.封闭：将小圆片挑出放到湿盒上，滴上封闭液，每片40 μL，室温2 h。

（膜
定位的分子封闭液里面不用加triton X-100）
5.一抗：封闭结束后，用滤纸在边缘吸掉封闭液，直接滴加一抗，用1% BSA
稀释，室温2 h，然后4 ℃过夜
6.复温0.5 h，PBS洗，5分3次
7.二抗：避光加入荧光二抗（1:1000），用PBS稀释，4 ℃孵育2 h，PBS洗，5
分钟3次
8.染核：Hochest或DAPI，用PBS稀释，可以和二抗一起加，1:1000，PBS洗，
10分3次（也可以单独加，1:800，室温20min）
9.封片：避光条件下，在载玻片上滴封片液，每个小圆片 6 μL，将小圆片倒
扣在封闭液上，注意不要产生气泡。

试剂配制：
细胞用PBS
NaCl 8.00 g
KCl 0.20 g
Na
2HPO
4
·12H
2
O 1.44 g
KH
2
PO4 0.24 g
ddH
2
O 至1000 ml
4% 多聚甲醛：多聚甲醛：PBS=1g：100 ml，按比例称取后，于电炉上加热，待溶解后，室温冷却后定容，然后定容，置于4度保存
封片液：丙三醇：PBS=1:1
组织荧光
1.冰冻切片放在37 ℃烘烤1 h，石蜡切片先脱蜡、水化、抗原修复，然后置于
PBS中浸泡
2.涂指甲油，封闭液室温封闭2 h
3.一抗：封闭结束后，甩掉多余的封闭液，直接滴加一抗，用1% BSA稀释，室
温2 h，然后4 ℃过夜
4.二抗：避光加入荧光二抗（1:1000），用PBS稀释，4℃孵育2h，PBS洗，5
分3次
5.染核：Hochest或DAPI，用PBS稀释，1:800，室温20min，PBS洗，10分3
次（也可以和二抗一起加，1:1000）
6.封片：避光条件下，在载玻片上滴封片液，每个玻片20 μL，将小圆片倒扣
在封闭液上，注意不要产生气泡
试剂配制：
1% triton X-100：triton X：PBS=1ml：100 ml
1% BSA：BSA：PBS=1g：100 ml
细胞用PBS：NaCl 8g
KCl 0.2 g
NaHPO4 1.44 g
KH2PO4 0.24 g
ddH
2
O 1000 ml
可溶形式GST融合蛋白的亲和纯化
试剂：
Lysis buffer (pH 7.5) 1 L
Tris (50 mmol/L) 6.057 g
NaCl (200 mmol/L) 11.688 g
DTT(2mmol/L)
HCl调节pH 至7.5
GST Elution Buffer
50mM Tris-HCl (pH 8.0)
10mM Glutathione
实验步骤：
1)在50 ml离心管中加入适量lysis buffer（每克菌体加入2~5 ml lysis
buffer，故需先初步估计菌体质量）。

2)加入终浓度为1 mg/ml的溶菌酶，冰上放置裂解30 min。

3)冰浴超声破碎菌体（工作3秒/冷却6秒/200W 60次）。

12,000 rpm离心20-30
min，收集上清液，以0.45μm滤膜过滤样品。

4)轻混Glutathione Sepharose 4B 树脂，使其与保存液混匀呈完全悬浮状态。

吸取一定量树脂（1ml沉积的树脂可纯化5mg目的蛋白质）悬液加到聚丙烯柱内，使树脂在重力作用下沉积。

5)以5倍柱体积的PBS (138mM NaCl , 2.7mM KCl, 10mM Na
2HPO
4
, 1.8mM KH
2
PO
4
）
洗柱。

6)上样，使样品靠重力缓慢流过柱子。

7)以10倍柱体积PBS淋洗。

8)加入1倍柱体积的 GST Elution Buffer(50mM Tris-HCl (pH 8.0), 10mM
Glutathione)，室温孵育10 min后，收集流出液，其中含有被纯化蛋白质。

9)重复洗脱一次，纯化后的蛋白取少量进行SDS-PAGE鉴定，剩余蛋白-80℃保
存。

10)以5倍柱体积的PBS洗柱，再生柱子。

第二节免疫共沉淀
1、细胞予预冷的0.01MPBS洗涤2次；
2、加入1ml PBS后，细胞刮冰上刮取细胞，移至1.5ml离心管中，1000g×5min离心收集细胞；
3、加入配置好的500μl细胞裂解液置于轮转仪上4℃轮转30min彻底裂解细胞，12000g 4℃离心10min，将上清液转移至新EP管。

4、预澄清加入20μl 混匀的Protein A/G beads，在DNA混合仪上转动1小时，900g 离心5min(4℃)，将上清液转移至新离心管，弃珠子。

5、取40-60μl上清液作为Input，加入等量2×SDS loading buffer，沸水煮5-10min，离心后冻存。

其余部分平分为两等分，分别加入等量（1μg）Normal IgG 或相应抗体, 在DNA混合仪上转动2小时（4℃）。

6、在每个离心管中各加入30μl 混匀的Protein A/G beads 继续转动2小时。

然后900g 离心5min（4℃），弃上清。

7、加入1ml洗涤缓冲液洗涤珠子。

900g离心5min（4℃），共洗涤3次。

最后将40-60μl 2×SDS loading buffer加入洗好的珠子中，沸水煮5-10min，离心后冻存。

8、连同Input样品一起进行Western blot检测。

裂解缓冲液的配制：
50 mM Tris-HCl (pH 7.5)
150 mM NaCl
5 mM EDTA (pH 8.0)
5 mM EGTA
15 mM MgCl
2
1% Nonidet P-40
临用前加入： 1 mM Na3VO4
25 g/ml phenylmethylsulfonyl fluoride （PMSF）
1 mM β-glycerophosphate
1× protease inhibi tor cocktail
洗涤缓冲液可直接用裂解液母液。

第三章细胞生物学实验
第一节细胞培养
一、细胞培养的注意事项
细胞培养在细胞房内进行，需严格遵守细胞房操作守则操作。

特别指出的是：
1、细胞房为细胞培养操作专用，不得在细胞房内进行非细胞培养操作。

凡是需要在细胞房培养细胞均需经过允许，并登记备案。

2、在细胞房培养细胞者严格按照其分配的位置摆放细胞培养物品、细胞及培养试剂，并在规定的操作台使用。

严禁在未告知对方的情况下随意使用他人的培养基、细胞器材！
3、在本细胞房培养细胞者进门时需要更换拖鞋、必须穿白大褂和戴手套（进行细胞操作必须佩带乳胶手套），操作之前，必须用酒精喷壶喷洒双手，保证双手均进行过消毒。

每次操作前请用紫外照射台面，并擦拭台面。

培养瓶进入培养箱前需要清洁其表面。

如发生培养瓶内培养基漏出，立即用酒精棉将瓶外表面及箱内污迹擦拭干净。

4、细胞操作完成之后，要清理台面上任何遗留的东西，包括枪头盒、滴管、手套和用完的培养皿等。

废液缸内的废液、枪头和滴管需要及时清理，再放回超净工作台内。

5、细胞房值日的同学每天清理细胞房，每周四打扫细胞房一次（包括垃圾清理和拖地），并且配制75%的酒精及灌装95%的酒精。

及时补充培养箱内无菌蒸馏水并应注意CO2浓度，发现问题及时报告。

6、细胞培养箱需要每月25号进行消毒。

培养细胞一经污染，需要及时汇报，寻找污染原因，并及时清理污染的培养箱和培养基。

二、细胞培养常用试剂的配制
1、0.01mM PBS：NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4 1.44 g，KH2PO4 0.24 g，H2O 800 ml，搅拌溶解，定容至1 000 ml，高压灭菌后4 ℃保存。

2、D-Hank’s液：NaCl 80.0 g，Na2HPO40.6 g，KCl 4.0 g，KH2PO40.6 g，H2O 800 ml，搅拌溶解，定容至1 000 ml，高压灭菌后4 ℃保存。

3、青霉素-链霉素储存液：青霉素40万U（5瓶）、链霉素4g（4瓶），H2O 400 ml，搅拌溶解，过滤灭菌后分装，-20℃保存。

使用时1:1000稀释，终浓度为100 U/ml青霉素和100 μg /ml链霉素
4、0.25%胰酶：胰酶0.25g，D-Hank’s液 100ml，搅拌溶解，过滤灭菌后4 ℃保存。

5、DMEM基础培养基：DMEM干粉1瓶，NaHCO3 3.7g，HEPES 2.73g，H2O 800 ml，搅拌。