哈茨木霉T代谢产物对花生种子活力和抗黄曲霉菌侵染能力的影响
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
2009年9月2009,31(3):370-373
中国油料作物学报
Chinesejournalofoilcropsciences
哈茨木霉T2-16代谢产物对花生种子活力和抗黄曲霉菌侵染能力的影响
魏 林1.2,梁志怀2,曹福祥1
,安哲宇3,李 林4,刘登望4
(1.中南林业科技大学,湖南长沙410004;2.湖南省植物保护研究所,湖南长沙410125;3中南大学研究生院隆平分院,湖南长沙410125;4.湖南农业大学花生研究所,湖南长沙410128)
摘要:应用哈茨木霉T2-16
发酵产物对花生进行浸种处理,测定该发酵产物对花生种子活力及抗黄曲霉菌侵染能力的影响。
结果表明:木霉发酵产物可提高花生的种子活力,表现为促进种子提早萌发、提高种子活力指数和降低种子相对电导率;该发酵产物可增强种子中与抗病性密切相关的酶活性,降低黄曲霉菌对花生的侵染。
关键词:木霉;代谢产物;花生;种子活力;黄曲霉菌;保护酶
中图分类号:S482.7,S565.2 文献标识码:A 文章编号:1007-9084(2009)03-0370-04
EffectsofmetabolicproductofTrichodermaT2-16o
nseedvigorandresistancetoAspergillsuflavusinpeanut
WEILin1,2,LIANGZhi-huai2,CAOFu-xiang1
,ANZhe-yu3,LILin4,LIUDeng-wang
4(1.CentralSouthUniversityofForestryandTechnology,Changsha410004,China;
2.HunanProvincialPlantProtectionInstitute,Changsha410125,China;
3.BranchofLongping,CentralSouthUniversity,ChangshaHunan410125,China;4.GroundnutInstitute,
CollegeofBioscience&Biotechnology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China)
Abstract:ThemetabolicproductofTrichodermaT2-16wasappliedinpeanutbysoakingseeds.TheeffectofT2-16metabolicproductonseedvigorandtheresistancetoAspergillsuflavuswerestudied.TheresultsshowedthattheT2-16metabolicproductincreasedgerminationpercentageandgerminationindexbutdecreasedrelativeelectricalconductivity,resultinginahighergerminationandseedvigor.Meanwhile,theresultsshowedthattheactivitiesre latedtodiseaseresistancesuchasPOD,PPOandPALwereincreased.TheinfectingpotentialofA.flavustopeanutseedswasdecreased.Therefore,itisconcludedthatT2-16metabolicproducthasafavorableeffectonincreasingthevigorofpeanutseedsandimprovingthequalityofpeanutseedlings.
Keywords:Trichoderma;Metabolicproduct;Groundnut;Seedvigor;Aspergillsuflavus;Protectionenzyme收稿日期:2008 11 12
基金项目:湖南省博士后科研资助专项计划项目(2008RS4028);国家“十一五”科技支撑计划项目(2006BAD17B08)作者简介:魏林(1970-)女,博士,主要从事农作物病害生物防治研究工作,Tel:0731-4693299,E-mail:weilincn@163.com
通讯作者:
曹福祥,教授,博士生导师 自20世纪50年代,人们认识到木霉菌(Tri choderma)对多种植物病原菌具有拮抗作用起,木霉作为一类较理想的生防益菌已成为作物病害防治的重要成员。
许多试验也证明生防木霉菌能防治花生
病害、促进花生生长和提高产量[
1~4]。
我们前期研究也表明哈茨木霉T2-16
液体发酵物(含孢子)对花生进行浸种处理,可显著提高花生出苗率和成苗率,矮化植株促发分枝,促进植株健壮生长。
花生成熟收获时调查表明,哈茨木霉T2-16
发酵物浸种后可提高花生产量,根腐病和荚腐病的发病
率也极显著低于对照[
1]。
在此基础上,本文进一步研究了哈茨木霉T2-16
发酵代谢产物对花生种子活力的影响,以期初步探明木霉促进花生生长的作用机制。
此外,本文还研究了该代谢产物对花生种子抗黄曲霉侵染的影响,为木霉菌对该病原菌的生物防治提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试的花生品种和黄曲霉菌菌株
品种为珍珠豆型花生品种花120,由湖南农业大学花生研究所提供,挑选大小、饱满度基本一致的种子进行试验。
强致病力黄曲霉菌菌株为湖南农业大学生态研究所馈赠。
1.2 木霉发酵代谢产物的制备
将哈茨木霉菌T2-16
菌株在PDA平板培养基上培养7
d后,用适量灭菌的0.1%吐温80将平板表面的孢子洗脱,将孢子浓度调节为1×108
孢子/mL后,取10mL孢子悬浮液接种于装有150mLGPF液体培养基(主要成分为葡萄糖、KH2PO4和少量的维生素,pH=6.2)的500mL三角瓶中,置于摇床中于25℃、150r/min条件下发酵培养7d。
以不接种木霉孢子的GPF培养液为参比对照。
然后在无菌的条件下,将发酵液用G3耐酸漏斗经0.22μm滤膜真空过滤,得到的滤液即为供试菌株的液体发酵代谢产物。
1.3 木霉发酵代谢产物对花生种子活力的影响
研究
1.3.1 花生种子处理 随机选取供试花生种子数粒,表面消毒后分别浸入盛有50mL如下处理溶液的烧杯中:哈茨木霉T2-16稀释10倍的发酵代谢产物、作为参比对照的GPF培养液和作为空白对照的灭菌水。
将烧杯置于室温下(26℃左右)浸泡6h后,取花生种子20粒放于铺有发芽滤纸的培养皿中,加水湿润滤纸。
在光照培养箱中25℃条件下培养,定期补充水分,重复3次。
1.3.2 种子活力指数的测定 每隔24h调查1.3.1中各处理种子发芽情况,种子发芽以胚根突破种皮后长度为种长一半时为发芽标准。
共调查7d,培养7d后将幼苗去掉子叶,用滤纸吸干幼枝叶表面水分,称重。
计算发芽率、发芽指数和活力指数,其中发芽率(%)=正常发芽种子数/种子总数;发芽指数(GI)=∑Gt/Dt(Gt为第t天的发芽数,Dt为相应发芽的日数);活力指数(VI)=发芽指数×(胚轴+胚根的长度)[6]。
1.3.3 种子外渗液相对电导率的测定 分别取1.3.1中不同浸种处理的萌发种子25粒,将其置于100mL烧杯中,加入50mL无离子水,于25℃条件下浸泡2h,用DDS-l1A型电导蚁测定浸泡液的电导值S1,然后将锥形瓶放置于沸水浴中20min,取出后定容至50mL,冷却后测定电导率值S2,相对电导率(%)=S1/S2×
100,重复3次,取平均值[7]。
1.4 木霉发酵代谢产物对花生种子抗黄曲霉菌侵
染能力的影响研究
1.4.1 花生种子处理 选取大小均匀无损、成熟饱满的供试花生种子,表面消毒后,如同方法1.3.1进行6
h的浸种处理。
1.4.2 黄曲霉菌的接种 将不同溶液浸种后的种子控干水分,分别放入灭菌的大培养皿中,加入含4
×10
6
个/mL孢子黄曲霉悬液5mL,轻摇培养皿,使菌液均匀分布于种子的表面,每皿50粒,重复3次,置于25±1℃温度条件下培养7d,检查籽粒染菌程
度[8]。
1.4.3 花生抗黄曲霉菌侵染能力的测定 接种7d后,分别调查不同浸种处理花生种子受黄曲霉菌侵染面积达1/3的粒数、达2/3的粒数和全部侵染的
粒数,并按下式计算病情指数和发病率[5]:
病情指数=(1×侵染面积达1/3的粒数+2×侵染面积达2/3的粒数+3×全部侵染的粒数)/3×总粒数×100;发病率(%)=侵染粒数/总粒数×100%。
1.4.4 花生种子保护酶的测定 黄曲霉菌接种7d后,随即取不同感染程度的花生种子两粒,混合粉碎后,取不同处理种子样本1g,分别测定不同浸种处理花生种子中苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)三种与抗病性密切相关的酶的活性。
其中PAL活性测定用氧化苯丙氨酸法,以每克种子1h内在OD290nm处吸收光度的变化表示酶活性;PPO活性用氧化儿茶酚法测定,以每克种子1min内在OD398nm处吸收光度的变化表示酶活性;POD活性以氧化愈创木酚法测定,以每克种子1min内在的OD470nm处吸收光度的变化表示酶活
性[
9,10]。
1.5 数据处理
所有数据均用DPS软件进行分析。
2 结果与分析
2.1 木霉发酵代谢产物对花生种子活力的影响
不同浸种处理花生种子的活力指数见表1。
由表1的数据可看出,经木霉发酵代谢产物浸种处理的花生种子,其发芽指数显著高于清水对照和GPF培养基浸种处理的参比对照;同时其浸种处理还能显著促进花生幼苗的生长,其处理的幼苗长度均显著优于参比对照和清水对照,相对应的活力指数也极显著高于两对照。
试验结果表明,木霉菌T2-16培养基对花生种子发芽及种子活力均无促进作用。
种子外渗液相对电导率反映了种子质膜透性,
1
73魏 林等:哈茨木霉T2-16
代谢产物对花生种子活力和抗黄曲霉菌侵染能力的影响
其数值与种子活力成负相关。
本试验中,经木霉发酵产物浸种处理后,供试的花生种子外渗液电导率显著低于两对照浸种处理(表1)。
表明菌株T2-16
发酵代谢产物可延缓花生种子细胞膜的劣变,对膜系统具有保护作用,进而提高种子的活力。
试验结果表明,木霉菌T2-16
培养基则不具备该种作用。
表1 木霉T2-16
代谢产物对花生种子活力的影响Table1 EffectofT2-16m
etabolicproductonseedvigorofpeanut处理
Treatment发芽指数
Germinationindex
幼苗长度/cm
Seedlinglength
活力指数
Vigorindex相对电导率/%
Relativeelectricconductivity
T2-16发酵产物T2-16
metabolicproduct75.17a
4.52a
339.76A
36.7bGPF培养液
GPFliquidmedium64.88b3.76b243.95B
60.2a无菌水Sterilewater62.35b3.81b237.55B54.1a
注:
表中大、小写字母分别表示达到1%和5%水平差异显著性,下同。
Note:Differentcapitalandsmallletterindicatedsignificantdifferencesat1%and5%respectively.Thesameasbelow
2.2 木霉发酵代谢产物对花生种子抗黄曲霉菌侵
染能力的影响
不同浸种处理的花生种子接种黄曲霉菌后,种子发病率及病情指数见表2。
试验结果表明,经木霉T2-16发酵产物浸种处理的花生种子接种黄曲霉菌后,种子发病率低于两对照浸种处理,尤其是病情指数极显著低于两对照处理。
试验调查发现,花生种子经木霉发酵产物浸种处理后,接种黄曲霉菌种
子被侵染率为90.0%,但低于参比对照(98.0%)和空白对照(100.0%)被侵染率。
而且木霉代谢产物浸种处理的花生种子受侵染的面积多为1/3~2/3,籽粒全部被侵染的只有2
0粒;而GPF培养液及清水浸种处理的种子全部被侵染的分别为47粒和52粒,与清水浸种处理的种子病情指数相比,木霉菌代谢产物处理的下降了33.77%,而参比对照GPF培养液的病情指数则与清水浸种的相当。
表2 木霉T2-16
代谢产物对花生种子抗黄曲霉侵染能力的影响Table2 EffectofT2-16
metabolicproductoninfectingpotentialofA.flavustopeanutseeds处理
Treatment发病率/%
Diseaserate受侵染数(粒)Thenumberofinfection
受侵染面积1/3
Infectedareareachedto1/3
受侵染面积2/3
Infectedareareachedto2/3
全部侵染
Infectedareareachedto100%
病情指数
Diseaseindex比无菌水对照
/±%Comparedtothesterilewatercontrol
T2-16
发酵产物T2-16
metabolicproduct90.088282045.33B-33.77GPF培养液GPFliquidmedium
98.048524765.11A-4.87
无菌水Sterilewater
100.0
44
54
52
68.44A
表3 霉T2-16
代谢产物对花生种子中抗病性相关酶活性的影响Table3 EffectofT2-16
metabolicproductontheactivitiesofprotectionenzymeinpeanutseeds处理
Treatment PAL
PPO
POD 酶活/
(U·g-1·h-1
)Enzymeactive
比无菌水对照/±%Comparedtosterilewater酶活/
(U·g-1·min-1
)
Enzymeactive
比无菌水对照
/±%Compared
tosterilewater
酶活/
(U·g-1·h-1
)Enzymeactive)
比无菌水对照
/±%Comparedtosterilewater
T2-16
发酵产物T2-16metabolicproduct17.71a61.740.39a56.005.10A50.44GPF培养液GPFliquidmedium11.66b6.48
0.21b-16.00
2.95B-12.98
无菌水Sterilewater
10.95b
0.25b
3.39B
接种黄曲霉菌后,不同浸种处理的花生种子中与抗病性密切相关的P
PO、POD和PAL3种酶活性见表3。
与参比对照及清水对照相比,木霉发酵产物浸种的花生种子中三种酶活性均有不同程度的提高,且与两对照相比差异显著。
由于这3种酶的活性与植物抵抗病原菌等逆境侵害的能力正相关,这也是经该发酵产物处理后,花生种子抗黄曲霉菌浸
染能力增强的原因之一。
此外,试验结果也表明,木霉菌T2-16
发酵培养基成分则无该作用。
3 讨论
已有的生防木霉菌多为活孢子制剂[1~4]
,该类
制剂在生产应用中常受到田间的温度、湿度、雨水、土壤微生物及化学农药等因素的干扰,大田防治效
2
73中国油料作物学报 2009,31(3)
果不稳定。
本试验中,我们用去除了菌丝体和孢子
的木霉菌T
2-16
发酵代谢产物对花生种子进行浸种处理,结果表明,该代谢产物可提高花生种子活力和幼苗长势。
这表明木霉菌代谢产物也具有与活菌体一样的促长功能。
此外,过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)均与植物的抗病性反应密切相关,它们活性高低与植物抵抗包括病害在内的逆境的能力关系密切,提高它们的活
性对增强植物的抗病性十分有利。
木霉T
2-16
发酵代谢产物对花生浸种处理,接种病原菌(黄曲霉菌)后,种子中这三种与抗性相关的酶活性均显著提高,
黄曲霉菌侵染能力降低,表明木霉T
2-16
的代谢产物与木霉活菌体一样,对病原菌具有拮抗作用,并可激发植物抗性防卫反应,这一结果为丰富哈茨木霉代谢产物的应用理论和探索其防病作用机制提供了新的线索。
种子在水中浸泡后,其吸胀过程可能对细胞膜造成损害,影响种子细胞膜的完整性,而细胞膜完整性是体现种子活力的一个重要生理特性指标,它调节溶质的进出,维持细胞内外的浓度梯度,以保证正常物质运转等生理功能,外渗液相对电导率的大小可以反映细胞膜受伤害的程度[11]。
通常种子活力高,细胞膜完整,外渗物含量少,电导率低;种子活力低,细胞膜老化,不完整,外渗物含量高,电导率则
高。
本试验中,哈茨木霉T
2-16
代谢产物对花生种子浸种处理后,降低了种子外渗液的相对电导率,表明该发酵代谢可能可以减少或修复膜的这种损伤,改变了干燥种子膜磷脂的物理状态,限制水分进入种子的速率,这样就可能减小种子因快速吸涨造成膜系统的损伤,有利于细胞膜的修复,减少营养物质的外渗。
本文对木霉菌液体发酵代谢产物提高花生种子活力及对黄曲霉菌等病原菌抗性诱导作用的研究结果,为扩大木霉这一生防菌的应用范围、应用方式提供了依据。
但对木霉代谢产物中对花生种子萌发具促进作用、对病原菌具诱抗作用的活性物质的定性及其作用方式、该代谢产物在田间应用效果都还有待于进一步研究。
参考文献:
[1] 刘登望,李 林,魏 林,等.哈茨木霉菌液在花生上的应用效果[J].花生学报,2006,35(2):34-36.[2] 曾华兰,叶鹏盛,李琼芳,等.哈茨木霉T23对花生的促生增产作用[J].云南农业大学学报,2005,20(1):
145-146.
[3] 陈建爱,王未名,刘益同.生物复合肥木霉T1010对花生生长的影响[J].花生学报,2008,37(3):29-32.[4] 黄亚丽,张丽萍,李书生,等.绿色木霉菌剂对花生重茬病害的防治效果研究[J].现代农药,2006,5(6):35
-37,39.
[5] 姜慧芳,任小平,王圣玉,等.花生黄曲霉侵染抗性持久性及种皮完整性对产毒的影响[J].作物学报,
2006,32(6):851-855.
[6] 聂呈荣,陈思果,温玉辉,等.模拟酸雨对花生种子萌芽及幼苗生长的影响[J].中国油料作物学报,2003,
25(1):34-36.
[7] 贾刚民.青霉素和Ca2+对花生老化种子发芽的影响[J].河南农业科学,2007,11:55-56.
[8] 姜慧芳,任小平,王圣玉.花生种质资源对黄曲霉菌侵染和产毒的抗性鉴定[J].中国油料作物学报,2005,
27(3):21-25.
[9] 梁炫强,周桂元,潘瑞炽.花生种子受黄曲霉菌侵染后若干生化成份的变化及其与抗性的关系[J].中国油
料作物学报,2001,23(2):26-30.
[10] 张志良,瞿伟箐.植物生理学实验指导[M].北京:高等教育出版社,2003.34-39,67-70.
[11] 谢 皓,陈学珍,钱宝玉,等.储藏年份对大豆种子活力及农艺性状的影响[J].北京农学院学报,2003,18
(4):281-284.
3
7
3
魏 林等:哈茨木霉T
2-16
代谢产物对花生种子活力和抗黄曲霉菌侵染能力的影响。