COXⅣ下调通过ROS_CXCR4通路促进肝癌转移的作用机制

COXⅣ下调通过ROS/CXCR4通路促进
肝癌转移的作用机制
摘 要
背景：肝癌是全球第六大最常见的癌症，第四大恶性肿瘤致死原因，在中国，每年死于肝癌人数达36.9万人，5 年总体生存率仅为 12.1%，发生转移是肝癌致死的主要原因，探寻其发生机制成为肝癌防治亟待解决的关键问题。

以往研究发现，线粒体功能紊乱与肿瘤的转移密切相关。

细胞色素C氧化酶亚基4(cytochrome c oxidase subunit 4， COXⅣ)是线粒体呼吸链的重要组分，表达异常可导致线粒体功能障碍，其能否参与肝癌的转移目前尚不清楚。

本课题拟通过体内﹑体外实验在肝癌组织，细胞及分子等多个层面探寻COXⅣ表达降低对肝癌转移的影响，并阐明其具体分子作用机制。

目的：1.通过对肝癌和肝癌旁组织中COXⅣ进行定量，明确COXⅣ在肝癌组织中的表达情况。

通过分析肝癌患者临床病理参数，阐明COXⅣ表达强度对患者预后的影响。

2.通过体内体外实验，明确COXⅣ在肝癌细胞侵袭迁移中的具体功能。

3.通过实验数据，明确COXⅣ与CXCR4在肝癌侵袭转移机制中的关系。

4.通过实验数据，明确线粒体COXⅣ、ROS和CXCR4在肝癌侵袭转移机制中的关系。

方法：1.利用qPCR，Western-blot及免疫组化的方法在肝癌及癌旁组织中检测COXⅣ的表达，统计学分析肝癌组织中COXⅣ的表达水平与肝癌患者预后之间的相关性。

2.在肝癌细胞系SNU-368及SNU-739中，干涉COXⅣ表达后，利用划痕及Transwell TM实验，体外验证COXⅣ表达降低促进肝癌细胞侵袭转移的作用。

构建带荧光素酶的COXⅣ稳定干涉的肝癌细胞株，利用此细胞株在BALB/c裸鼠体内构建荷瘤模型，体内验证COXⅣ表达降低促进肝癌细胞侵袭转移的作用。

3.在SNU-368及SNU-739肝癌细胞系干涉COXⅣ表达后，Western-blot及免疫荧光检测COXⅣ表达降低对CXCR4表达的影响。

利用抑制剂阻断CXCR4作用后，划痕实验及Transwell TM实验检测COXⅣ干涉对肝癌细胞侵袭迁移能力的影响。

4.Mitosox及流式细胞术检测 COXⅣ干涉后，肝癌细胞内线粒体ROS水平的改变，利用还原剂NAC降低细胞内ROS 水平后，Western-blot 检测COXⅣ干涉对CXCR4表达水平的影响。

结果：1.qPCR，Western-blot及免疫组化结果显示：与癌旁组织相比，COXⅣ在肝癌组织中的表达显著降低。

统计学分析结果显示：COXⅣ在肝癌组织中的表达与肝癌PVTT、TNM stage及组织分化显著相关；COXⅣ表达低的肝癌患者其总生存期和无病生存期均显著低于COXⅣ表达较高的肝癌患者。

2.体外及体内实验均证实干涉COXⅣ表达后，肝癌细胞侵袭转移能力显著增强。

3.干涉肝癌细胞COXⅣ表达后，CXCR4的表达水平显著升高，利用抑制剂阻断CXCR4作用后，可显著抑制COXⅣ干涉所导致的肝癌细胞侵袭转移能力的增强。

4.肝癌细胞中，干涉COXⅣ表达后，线粒体活性氧水平显著升高；利用还原剂降低细胞内ROS水平后，可显著抑制COXⅣ干涉所导致的CXCR4表达升高。

结论：COXⅣ在肝癌组织中的表达较癌旁组织显著降低，COXⅣ表达越低的肝癌患者其预后越差。

COXⅣ表达降低通过促进线粒体ROS生成上调CXCR4表达，最终增强肝癌细胞的侵袭转移。

我们的研究结果揭示了一种肝癌转移的新机制，为肝癌的临床防治提供新的潜在靶点。

关键词：COXⅣ、CXCR4、ROS、肝癌
Down-regulation of COXⅣ promotes metastasis of hepatocellular carcinoma via ROS/CXCR4 signaling pathway
Abstract
Background：Liver cancer ranks sixth in cancer incidence and second in cancer mortality. In China，the number of people who died of liver cancer reaches 369，000 every year，and the overall 5-year survival rate is only 12.1%. Metastasis is the main cause of liver cancer death. Exploring its mechanism has become a key problem in the prevention and treatment of liver cancer. Previous studies have found that mitochondrial dysfunction is closely related to tumor metastasis. Cytochrome C oxidase subunit 4(cytochrome c oxidase subunit 4，COXⅣ) is an important component of mitochondrial respiratory chain，and its abnormal expression can lead to mitochondrial dysfunction. It is not clear whether it can promote the metastasis of liver cancer. By means of in vivo and in vitro experiments，we will explore the effect of COXⅣ expression reduction on liver cancer metastasis and clarify its molecular mechanism.
Objective: 1.The expression of COXⅣ in liver cancer tissues was determined by quantitative COXⅣ in liver cancer and adjacent tissues. And the effect of COXⅣexpression intensity on the prognosis of patients was clarified by analyzing the clinicopathological parameters of liver cancer patients.
2. And we conducted in vivo and in vitro experiments to clarify the specific function of COXⅣ expression in the invasion and migration of hepatocellular cells.
3.Confirm the relationship between COXⅣ and CXCR4 in the mechanism of invasion and metastasis of liver cancer through experimental data.
4.Clarify the specific relationship among COXⅣ、mitochondrial ROS and CXCR4 in the mechanism of invasion and metastasis of HCC through experimental data.
Methods :1. QPCR，Western-blot and immunohistochemistry were used to detect the differences in the expression of COXⅣ in liver cancer and adjacent tissues， and the
correlation between the expression level of COXⅣ in liver cancer tissues or the prognosis of liver cancer patients was statistically analyzed.
2.After interfering with the expression of COXⅣ in SNU-368 and SNU-739 hepatocellular carcinoma cell lines，the effect of reducing the expression of COXⅣ in promoting invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma cells was verified in vitro by using scratch and Transwell TM experiments. A COXⅣ interference-stabilized hepatocellular carcinoma cell line with luciferase was constructed，and a tumor-bearing model was constructed in nude mice.
3.After interference of COXⅣ expression in hepatocellular carcinoma cell lines SNU-368 and SNU-739， the effect of decreased COXⅣ expression on CXCR4 expression was detected by Western-blot and immunofluorescence. After blocking the effect of CXCR4 with an inhibitor， the Transwell TM assay examined whether changes in the invasion and migration capacity of HCC cells induced by COXⅣ interference were affected.
4. MitoSOX and flow cytometry were used to detect the changes of mitochondrial ROS levels in hepatocellular cells after COXⅣ interference. After reducing the intracellular ROS levels with reducing agents，Western-blot was used to detect whether the changes in CXCR4 expression caused by COXⅣ interference were affected.
Results:1.The results of qPCR，Western-blot and immunohistochemistry showed that the expression of COXⅣ in liver cancer tissues was observably decreased when compared with that in paracancer tissues. The results of statistical analysis showed that the expression of COXⅣ in liver cancer tissues was markedly correlated with the PVTT，TNM stage and tissue differentiation of liver cancer. The disease-free survival and overall survival of HCC patients with low COXⅣ expression were dramatically lower than those with high COXⅣ expression.
2.In vitro and in vivo experiments confirmed the interference with COXⅣexpression significantly enhanced the invasion and metastasis of HCC cells.
3. After interfering with the expression of COXⅣ in HCC cells， the expression level of CXCR4 was significantly increased. Blocking the effect of CXCR4 with
inhibitors could memorably inhibit the increased invasion and metastasis of HCC cells caused by COXⅣ interference.
4.After interfering with the expression of COXⅣ in liver cancer cells，the level of mitochondrial reactive oxygen increased significantly; The use of reducing agent can markedly block the rising of CXCR4 expression caused by COXⅣ interference after reducing intracellular ROS level.
Conclusion：The expression of COXⅣ in hepatocellular carcinoma tissues is significantly lower than which in paracancer tissues， and the decreased COXⅣexpression enhance the invasive migration of hepatocellular cells by way of promoting mitochondrial ROS to up-regulation of CXCR4. As a result，the lower expression of COXⅣ is always related to worse prognosis. This essay reveal a new mechanism of liver cancer metastasis and provide a new potential target for the clinical prevention and treatment of hepatocellular。

Keywords:COXⅣ；CXCR4；ROS；Hepatocellular
目 录
引 言 (1)
绪论 (3)
1. 肝癌的研究进展 (3)
2. COXⅣ的研究进展 (6)
3. CXCR4的研究进展 (7)
4. 活性氧与CXCR4 (10)
第一部分肝癌组织COXⅣ表达及临床意义研究 (11)
1. 材料 (11)
1.1 肝癌组织样本 (11)
1.2 实验试剂 (11)
2. 实验方法 (14)
2.1 RT-qPCR实验 (14)
2.2 Western-blot蛋白质印迹法 (14)
2.3 免疫组化 (20)
2.4 统计分析 (23)
3. 结果 (23)
3.1 COXⅣ在肝癌组织表达较癌旁组织显著降低 (23)
3.2 COXⅣ表达水平与肝癌患者预后相关 (23)
3.3 COXⅣ表达水平与临床参数之间的相关性.......................................24 4. 讨论 (25)
第二部分 COXⅣ表达下调促进肝癌细胞侵袭转移的作用研究 (27)
1 材料 (27)
1.1 研究对象 (27)
1.2 实验试剂 (27)
2. 实验方法 (29)
2.1 细胞胞培养及转染 (29)
2.2 Western-blot检测 (31)
2.3 细胞划痕实验 (31)
2.4 Transwell TM检测 (32)
2.5 体内实验 (33)
3. 结果 (34)
4. 讨论 (38)
第三部分 COXⅣ表达下调促进肝癌转移的分子机制研究........................40 1. 材料 (40)
1.1 研究对象 (40)
1.2 试剂和材料 (40)
2. 实验方法 (41)
2.1 Western-blot实验 (41)
2.2 细胞免疫荧光 (41)
2.3 划痕实验 (42)
2.4 Transwell TM实验 (42)
3. 结果 (43)
3.1 COXⅣ表达下调促进CXCR4的表达 (43)
3.2 COXⅣ表达下调通过促进CXCR4表达增强肝癌细胞的侵袭转移 (44)
4. 讨论 (46)
第四部分 COXⅣ表达下调促进CXCR4的作用机制研究 (47)
1. 材料 (47)
1.1 研究对象 (47)
1.2 试剂和材料 (47)
2. 实验方法 (47)
2.1 MitoSOX TM检测线粒体ROS (47)
2.2 Western-blot检测COXⅣ和CXCR4的蛋白含量 (47)
3. 结果 (48)
3.1 COXⅣ表达降低促进了线粒体ROS 生成 (48)
3.2 COXⅣ表达降低促进CXCR4的转录表达必须线粒体ROS介导 (49)
4. 讨论 (49)
结论 (51)
展望 (51)
参考文献 (53)
致谢 (63)
攻读硕士期间成果 (64)
缩 略 语
缩略词英文全称中文
COXⅣcytochrome c oxidase subunit four 细胞色素C氧化酶亚基4
ROS reactive oxygen species 活性氧簇
CXCR4 C-X-C chemokine receptor four 趋化因子受体4
JAK janus
kinase 酪氨酸激酶
STAT signal
transducer and activator of
transcription
信号传导及转录激活因子
SOCS Suppressor of cytokine signaling 细胞因子信号抑制物
RG7321 Pictilisib 2-(1H-吲唑-4-基)-6-[[4-(甲基磺酰
基)-1-哌嗪基]甲基]-4-(4-吗啉基)噻
吩并[3，2-d]嘧啶
KRX-0401 Perifosine 派立福新
VEGF vascular endothelial growth factor 血管内皮生长因子
HGF hepatocyte
growth
factor 肝细胞生长因子
c-Met mesenchymal epithelial transition factor 间充质上皮过渡因子
PTEN gene of phosphate and tension homology
deleted on chromsome ten 10号染色体缺失的磷酸盐和张力同源性基因
PI3K Phosphoinositide
3-kinase
regulatory
subunit 6
磷酸肌醇3-激酶调节亚基6 Akt/PKB protein kinase B 蛋白激酶B
mTOR mammalian target of rapamycin 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白MAPK mitogen-activated
protein
kinase 丝裂原活化蛋白激酶
GDP Guanine dinucleotide phosphate 鸟嘌呤二核苷酸磷酸
GTP Guanine trinucleotide phosphate 鸟嘌呤三核苷酸磷酸
Ser Serine 丝氨酸
Thr Threomine 苏氨酸
MCUR1 Mitochondrial calcium uniporter regulator 1线粒体钙单分类器调节剂1 Nrf2 nuclear
factor
E2-related factor 2 核因子E2相关因子2 NOTCH1 Neurogenic locus notch homolog protein1 神经源性位点缺口同源蛋白1
EMT Epithelial-Mesenchymal
Transition 上皮间充质转化
NAD nicotinamide adenine dinucleotide 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
dismutase2 超氧化物歧化酶2
SOD2 Superoxide
TCF12 transcription factor 12 转录因子12
stromal cell-derived factor-1 基质细胞衍生因子-1
SDF-1
α/CXCL12
matrix 细胞外基质
ECM extracellular
TEMED N，N，N’，N’-Tetramethylethylenediamine四甲基乙二胺
Receptor 雌激素受体
ER Estrogen
HBsAg hepatitis B surface antigen 乙型肝炎病毒表面抗原PVTT portal vein tumor thrombus 门静脉癌栓
AMD3100 Plerixafor 普乐沙福
FITC fluorescein
isothiocyanate 异硫氰酸荧光素
3 花青素3
Cy3 cyanin
DAPI 4'，6-diamidino-2-phenylindole 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚
kappa-B 核因子κB
factor
NF-κB nuclear
BMAL1 brain and muscle arnt-like 1 大脑和肌肉类细胞节律因子
COXⅣ表达下调通过ROS/CXCR4通路促进肝癌侵袭转移的作用机制
COXⅣ表达下调通过ROS/CXCR4通路促进
肝癌侵袭转移的作用机制
引 言
肝癌是危害人类健康的重大疾病，其发病率居全球第六，死亡率居第四[1]。

在我国，每年有30多万人死于肝癌，占全球肝癌病死率的一半以上[2]。

目前早期肝癌的治疗主要采取的是手术切除，但是由于肝癌发病隐匿，大部分患者发现时已是中晚期，错失了手术治疗的最佳时机。

近年来随着外科手术的发展及新型筛查标志物的应用，肝癌患者进行手术几率显著提高，但其生存率却并未得到明显改善。

主要原因在于肝癌术后极易发生转移。

尽管目前关于肝癌转移机制的研究取得了一定的进展，但是可转化为临床治疗的研究仍极其有限。

因此，加强肝癌转移的系统研究，筛选鉴定新的关键分子并阐明其影响肝癌转移的具体作用机制，是当前肝癌转移防治亟待解决的关键问题。

线粒体是真核细胞内重要的细胞器，其主要功能是通过内膜呼吸链的氧化磷酸化不断产生ATP 为细胞各种生命活动提供能量，此过程伴随产生的“质子漏”是细胞内ROS的主要来源。

线粒体功能异常与包括肿瘤在内的多种疾病的发生发展密切相关。

COXⅣ是线粒体呼吸链终末复合物的重要组成部分，其表达水平与线粒体功能密切相关。

COXⅣ表达下调可导致线粒体功能障碍，线粒体ROS生成增多；反之，COXⅣ表达增高，可显著促进线粒体的功能。

研究发现，白血病细胞COXⅣ表达降低有助于白血病细胞耐受缺氧[3]。

经过亚硝酸处理的SMMC-7721肝癌细胞其浸袭转移能力明显增强同时伴随COXⅣ的表达显著降低[4]，提示COXⅣ表达异常与多种肿瘤的发生发展紧密相关。

趋化因子受体 CXCR4 是趋化因子 CXCL12 特异性配体。

近年来研究发现CXCR4在肿瘤组织中的表达显著增高且与肿瘤转移密切相关。

Muller 等发现乳腺癌细胞表面高表达 CXCR4，其与乳腺癌的远处转移紧密相关[5]。

Ma 等发现神经母细胞瘤可通过上调CXCR4表达促进其远处转移[6]。

Scala等报道高表达CXCR4的
引 言
黑色素瘤患者其病情进展更快[7]。

此外，CXCR4在肝癌组织中的表达显著升高，且与肝癌的侵袭转移密切相关。

CXCR4 的表达受ROS[8]，HiF1[6]，TGF-β[9]等多种信号分子的调控。

细胞内ROS主要来源于线粒体氧化呼吸链的“质子漏”，氧化呼吸链功能异常会导致细胞内ROS的水平显著增高。

COXⅣ作为线粒体氧化呼吸链的重要组分，其表达异常可导致线粒体氧化呼吸链功能异常，ROS生成显著增多。

ROS 作为细胞内重要的活性分子其生成增多是促进肿瘤发生发展的重要因素。

线粒体功能异常在肝癌发生发展的研究是肿瘤研究的热点，然而关于COXⅣ促进肝癌发生发展的作用机制未见报道。

COXⅣ在肝癌中的表达情况如何？COXⅣ能否成为肝癌预后的分子标志物? COXⅣ在肝癌转移中发挥怎样的功能？COXⅣ表
达水平在肝癌转移中会不会对其他分子产生调控？这些问题就是本研究的重点。

COXⅣ表达下调通过ROS/CXCR4通路促进肝癌侵袭转移的作用机制
绪 论
1. 肝癌的研究进展
1.1肝癌的流行病学特征及诊治现状
肝癌即肝脏恶性肿瘤（liver cancer），可分为原发性和继发性两大类。

原发性肝癌是指发生在肝细胞或肝内胆管细胞的癌肿，其中肝细胞癌占原发性肝癌中的绝大多数，胆管细胞癌不足5%。

该病恶性程度高，浸润和转移性强 [10]。

根据2018年全球恶性肿瘤统计数据显示，肝癌是全球第六大最常见的癌症，也是世界范围内第四大最常见的恶性肿瘤死亡原因。

全球每年有超过80万新发肝癌病例，死于肝癌人数达到78万[1]，肝癌较高的发病率和死亡率仍是一个世界难题。

在中国，肝癌的发病率位于恶性肿瘤发病率的第四位，死亡率排在第二位，中国新发肝癌人数达到39.5万，死亡人数达到36.9万，中国每年新发肝癌人数占总发病率的47%，2012—2015 年间的一项调查分析发现，中国肝癌5 年总体生存率仅为12.1%，其中城市肝癌5年总生存率为 14.0%；农村肝癌5年总生存率为11.2%[2]。

目前，肝癌的发病原因尚未完全明确，通常认为与饮酒、肝硬化、黄曲霉素，病毒性肝炎、寄生虫、遗传等因素有关。

乙型病毒性肝炎是导致我国肝癌发生的主要原因，其90%的肝癌患者中发现体内有乙型病毒存在[10]，而在欧美国家丙型病毒性肝炎更常见。

肝癌常见的症状有肝部疼痛、食欲减退、乏力、恶心、呕吐、腹泻等，体检时可见肝脾肿大、腹水、黄疸等。

近年来，在肝癌诊断方面，除肝癌筛查的肿瘤标志物甲胎蛋白外，磷脂酰基醇蛋白聚糖3、异常凝血酶原、甲胎蛋白异质体等标志物的检测也逐渐走向临床；除此之外液体活检技术，如微小核糖核酸、循环肿瘤细胞、循环肿瘤 DNA也逐渐尝试应用于肝癌早筛。

目前肝癌的常用治疗方法有手术切除、肝移植、射频消融术、血管介入、放射治疗、免疫治疗、酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼等，其中手术治疗为肝癌治疗的首要选择，为根治肝癌提供了可能。

部分早期肝癌患者在手术后可以得到根治，但仍有部分早期肝癌患者手术后再次复发；中晚期肝癌因发生转移，失去根治机会，多采用非手术姑息治疗。

当前晚期的肝癌病人5年存活率只有3-5%[11]。

在中晚期肝癌治疗方面，索拉菲尼等酪氨酸激酶抑制剂取得了一些疗效，但由于索拉菲尼耐
绪 论
药和导致严重的肝功能障碍，大大限定了它的使用范围。

当前，肝癌的复发转移仍是影响治疗效果和长期生存的首要问题，需要继续对肝癌复发转移的机制进行深入研究。

1.2 肝癌发生发展的分子机制
在肝细胞性肝癌中，参与生长、分化、抗凋亡和血管生成的各种信号通路被异常激活，有助于肝癌的发生和进展[5]。

肝癌中常见激活的基因信号通路包括：JAK/STAT通路、WNT/β-catenin通路、PI3K/AKT/MTOR通路和RAS/RAF/MAPK 通路、VEGF相关信号通路、HGF及其受体(c-Met)信号通路等[12]。

①JAK/STAT信号通路的异常活化。

JAK（janus kinase）/STAT（signal transducer and activator of transcription，STAT）通路由JAK（janus kinase）家族蛋白和STAT家族蛋白成员参与组成。

JAK家族蛋白包括JAK1、JAK2、JAK3和TYK2，是一类非受体酪氨酸激酶家族，JAK家族成员被抑制或过度表达会导致增殖、血管生成、免疫监视、侵袭和转移的下游靶基因的失调[13]。

人类STAT蛋白家族由7个成员组成：STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6，其中STAT3是STAT家族的明星分子，一般呈现单体形式，当遇到JAK活化后，形成二聚体入核，激活下游的分子执行功能。

许多研究表明，肝癌中JAK/STAT通路的活性增强，STAT3在60%的肝癌中均表达增高，参与肝癌的增殖、抗凋亡、血管生成、代谢重编程、侵袭和转移[14]。

JAK/STAT信号上调与炎症信号的增加、生长因子的刺激、氧化应激和SOCS基因的表观遗传沉默都密切相关[15]。

Liu K等人发现，JAK/STAT信号通路的活化促进了肝癌的增殖和转移，利用灯盏乙素抑制JAK/STAT通路可以抑制肝癌的增殖和迁移能力[16]。

② WNT/β-catenin通路是肝癌发生发展的重要信号分子传导途径，是当前WNT研究的热点。

WNT信号参与了胚胎发育和正常成人机体稳态所必需的许多基本过程，是一个进化中高度保守的蛋白家族。

人类WNT家族由19种不同的富含半胱氨酸的糖蛋白组成，它们作为配体作用于15种以上的受体发挥作用，随着深入的研究，发现WNT家族的作用机制相当复杂[17]。

β-catenin是一种高度不稳定的蛋白质，在细胞核中，β-catenin可以结合WNT的靶基因进行染色质修饰[18]。

WNT/β-catenin通路已经被证实是器官正常发育所必需的，在许多细胞功能的执行中发挥重要作用，包括细胞的分化、增殖、抗凋亡等。

WNT基因突变会导
COXⅣ表达下调通过ROS/CXCR4通路促进肝癌侵袭转移的作用机制
致多种疾病，如：II型糖尿病[19]，白血病[20]，结肠癌[21]，肝癌[22-23]等，近80%的肝癌中WNT表达活化，多种针对WNT的靶向药物研制也在快速进行中。

OMP-54F28是WNT抑制剂，OMP-54F28联合索拉菲尼的药物实验已经进入临床实验阶段[12]。

③PI3K/AKT/mTOR信号通路包括磷脂酰肌醇激酶(PI3K)、蛋白激酶B (AKT)和雷帕霉素靶蛋白（mTOR）。

在肿瘤细胞的增殖、迁移、细胞抗凋亡、自噬以及糖代谢中都发挥重要作用[24]。

已经证实PI3K/AKT/mTOR信号通路可以和原癌基因Ras、Myc、以及抑癌基因p53、PTEN相互作用，引起原癌基因活化、抑癌基因抑制、细胞自噬功能失调，导致肿瘤细胞发生发展。

在超过半数的肝癌中可以发现mTOR的表达明显上调，在50%的肝癌中PTEN表达受到抑制，而研究发现PTEN的抑制与PI3K/AKT/mTOR信号通路活化显著相关[25]。

PI3K/AKT/MTOR还与p38-MAPK信号通路关系密切，研究发现，miR-129-3p在下调时，PI3K/Akt和p38-MAPK信号通路共同被活化，参与促进肝癌细胞的EMT、肝内和肝外的转移[26]。

现在，针对PI3K/AKT/mTOR通路的靶向治疗药物正在研制，例如针对PI3K的抑制剂RG7321，针对AKT的抑制剂KRX-0401，针对MTOR的抑制剂西罗莫司(Sirolimus)已经应用于中晚期肝癌的临床评估[12]。

④RAS /RAF/MAPK通路，RAS是ras基因表达产物，是一种小的GTP结合蛋白，具有明显的开关作用，在结合GDP时处于失活状态，结合GTP时处于活化状态。

RAF蛋白具有Ser/Thr蛋白激酶活性，是MAPK的激活因子，也可被RAS激活。

MAPK(有丝分裂原激活的蛋白激酶)位于RAF下游，被活化后进入细胞核，将很多底物蛋白的Ser/Thr残基磷酸化，对它们进行修饰。

RAS/RAF/MAPK信号通路在细胞迁移、增殖、血管生成、细胞凋亡中发挥着重要作用。

在肿瘤中RAS激酶的活化，核基因的变异较为普遍，有90%的肝癌中发现RAS/RAF/MAPK通路的活化[27]。

索拉菲尼可以明显的抑制Raf活性，其在晚期肝癌的治疗效果明显，是公认的RAS /RAF/MAPK信号通路靶向抑制剂。

⑤另外，VEGF相关信号通路、HGF及其受体(c-Met)信号通路在肿瘤的血管生成方面发挥着重要作用。

VEGF是血管生长因子家族，它可与受体VEGFR-1和VEGFR-2结合，调节肿瘤血管的生成；与受体VEGFR-3结合，调节肿瘤淋巴管的生成；在很多血管生成相关的疾病中表达增高，与肿瘤的关系密切。

研究证实，抑制VEGF的生成，可以抑制肿瘤血管的生长从而导致肿瘤的增长减缓，VEGF已经成为肝癌血管异常
绪 论
增生的治疗靶点，临床针对VEGF靶点治疗的药物有贝伐单抗、沙利度胺等。

c-Met 是由原癌基因Met所编码生成的一种蛋白，属于酪氨酸激酶的一种，可与间充质细胞分泌的HGF进行结合。

研究发现，在肝癌中，HGF/c-Met表达激活，与肝癌的增殖和转移关系密切[28]。

同时HGF/c-Met可以和VEGF通路互相作用，促进肝癌的增殖转移[29]。

大量研究发现，肝癌的转移与线粒体功能密切相关。

Geng X报道，TFB2M过表达可以造成线粒体功能紊乱，从而导致活性氧增高，通过AKT-NF-κB信号促进肝细胞癌的生长和转移[30]。

Zhuang X等人发现，miR-181a-5p通过调节线粒体呼吸链电子传递促进肝癌糖代谢重编程。

在肝癌细胞中过表达miR-181a-5p后，线粒体功能紊乱，线粒体膜电位(MMP)降低，可引起糖代谢重编程，促进肝癌生长和早期肺转移[31]。

Jin M等人发现，MCUR1介导的线粒体Ca信号，可以导致线粒体功能紊乱，线粒体呼吸链产生ROS增高，通过激活Nrf2/Notch1通路促进肝癌细胞的EMT [32]。

Ren T等研究发现，MCU依赖的线粒体Ca，通过抑制NAD/SIRT3/SOD2通路，导致线粒体功能紊乱，线粒体ROS生成增多，促进了肝癌细胞的发生和转移[33]。

LeeJH等报道，线粒体呼吸链功能障碍，造成ROS增多，通过活性氧介导的热休克因子1激活诱导Claudin-1的表达，从而导致肝癌细胞的侵袭性[34]。

综上提示多种机制可以促进肝癌的发生发展，线粒体功能紊乱也可以通过多种通路促进肝癌发生发展，线粒体功能与肝癌发生发展密切相关。

2. COXⅣ的研究进展
COXⅣ是线粒体呼吸链复合物IV的亚基，线粒体呼吸链复合物IV又称细胞色素C氧化酶，由线粒体和核基因组编码的13个结构亚基组成，是线粒体呼吸链中驱动氧化磷酸化的终末酶复合物。

COXⅣ参与细胞色素C氧化酶的组装，是COX 中最大的核编码亚基，它的位置紧邻催化亚基I和II的接触位点，使它成为调节COX活性非常重要的蛋白[35]，在调控细胞色素C氧化酶中发挥关键作用，对于维护线粒体呼吸链功能的完整性有重要意义。

以往研究表明，COXⅣ的缺失与线粒体功能异常密切相关，当线粒体受到电离辐射时，会导致线粒体功能障碍，COXⅣ表达下调，线粒体ROS增高，增高的线粒体ROS可以间接调控COXⅣ的表达，促进线粒体功能的恢复[36]。

Stepto NK
COXⅣ表达下调通过ROS/CXCR4通路促进肝癌侵袭转移的作用机制
等发现，经过短期强化循环训练，骨骼肌细胞中PGC1α和COXⅣ的 mRNA和蛋白表达增加1.5倍，保证了人体骨骼肌对急性和慢性反应的适应性[37]。

这些结果均明确表明COXⅣ的表达对线粒体功能的维护具有重要的作用。

在心肌细胞中，COXⅣ表达下降和心肌功能不全呈现正相关[38]。

范可尼贫血是一种常染色体隐性遗传性贫血，发病原因是COXⅣ基因K101N位点突变，可导致患者身材矮小，体重增长缓慢[39]。

此外，COXⅣ表达下降与阿尔茨海默病密切相关，在阿尔茨海默病的患者中，女性患者子女体内血小板线粒体的COXⅣ降低[40]。

COXⅣ表达下降也与帕金森病密切相关，Shamir R等人通过对523例帕金森病人的基因和蛋白组分析发现，帕金森病人中与线粒体相关的基因定位失调，包括COXⅣ，ATP5A1和VDAC3基因的表达下调[41]。

国内外研究发现COXⅣ在肿瘤的发生发展中也起着非常重要的作用。

在神经胶质瘤中，COXⅣ-1的表达增高，可导致细胞线粒体ROS的增高，促进神经胶质瘤细胞的增殖[42]；Goto M等人发现，在白血病细胞缺氧状态下，THP-1通过上调线粒体蛋白酶LON的表达来替代COXⅣ亚基，使白血病细胞适应细胞缺氧[3]。

Gui 等人发现，经过亚硝酸处理的SMMC-7721肝癌细胞的侵袭和转移能力明显增强，线粒体聚集减少，细胞的COXⅣ的表达显著降低[4]。

通过以上的研究我们可以得出，COXⅣ的正常表达可以为机体功能的正常发挥提供保障，在多种肿瘤中都存在COXⅣ表达异常和线粒体功能的异常。

但COXⅣ在肝癌细胞中作用机制尚未见报道。

3. CXCR4的研究进展
3.1 CXCR4的特征和功能
CXC族趋化因子受体（C-X-C chemokine receptor ，CXCR）是以四个高度保守的半胱氨酸氨基酸残基为特征，其中有两个半胱氨酸残基和一个非半胱氨基酸残基，在第一个半胱氨酸氨基酸残基之前存在由谷氨酸-亮氨酸-精氨酸基序构成的结构功能域，它们拥有诱导或抑制血管生成的独特性质，趋化因子受体首次发现是在免疫细胞定向迁移至炎症和损伤部位时，充当了白细胞趋化因子的介体。

趋化因子受体还参与了器官发育，血管生成，肿瘤发生，并且与机体的免疫应答息息相关[43]。