巴什拜羊ISG15基因的克隆与序列分析

巴什拜羊ISG15基因的克隆与序列分析
崔茹鹏;沈文;鲁海富;孙延鸣
【摘要】本研究旨在了解新疆巴氏拜羊类泛素蛋白ISG15基因的序列特征.采集巴什拜羊外周血液,从中分离得到淋巴细胞并提取RNA,设计特异性引物进行RT-PCR,克隆出巴什拜羊ISG15基因序列,回收PCR产物与pMD18-T载体连接后转化
DH5α,检测阳性克隆、测序并进行序列分析.结果表明,克隆的巴什拜羊ISG 15基因编码区全长为522 bp,编码172个氨基酸.BLAST结果表明,巴什拜羊ISG15基因与绵羊、山羊、小尾寒羊、水牛、牛和野猪的ISG15基因序列同源性分别为99％、98％、95％、94％、94％和82％.构建基因进化树分析结果显示,巴什拜羊与绵羊先聚为一类,再与小尾寒羊聚为一类,然后和牛聚为一类.该聚类结果与生物学上的分类一致.%In order to study the molecular construction of the ISG15 gene from Xijiang Bashibai sheep, RNA was extracted from the lymphocyte, which was isolated from the peripheral blood of the Bashibai sheep. The specific primer designed was amplified by the RT-PCR method. Then cloned the gene order of Bashibai sheep, PCR products that were reclaimed were cloned into pMD18-T vector, and then transformed into DH5α, detected masculine clone, proceeded sequence analysis. The conclusion showed that total length of the genetic coding region cloned from Bashibai sheep is 522 bp, and 172 amino acids were encoded. BLAST analysis showed that Bashibai sheep /SG15 gene shared 99%, 98%, 95%,94%,94% and 82% homology with those of Ovis aries, goat, Ovis aries breed Small Tail Han, Bubalus bubalis, bos and Sus scrofa respectively. Molecular phylogenetic tree analysis showed that Bashibai sheep
assembled to Ovis aries, then assembled to Ovis aries breed small Tail Han and bos. The clustering was identical to the biological classification.
【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2012(039)006
【总页数】5页(P93-97)
【关键词】巴什拜羊;ISG15基因;克隆;序列分析
【作者】崔茹鹏;沈文;鲁海富;孙延鸣
【作者单位】石河子大学动物科技学院,新疆石河子832003;石河子大学动物科技学院,新疆石河子832003;石河子大学动物科技学院,新疆石河子832003;石河子大学动物科技学院,新疆石河子832003
【正文语种】中文
【中图分类】Q78
ISG15蛋白是哺乳动物细胞受到干扰素和病毒刺激后高效表达的一种蛋白质（Der 等，1998；Ritchie等，2004；Nicholl等，2000）。

研究结果表明，ISG15及蛋白质的ISG15共价修饰对刺激细胞增殖（Rempel等，2007）、增强细胞抗病毒作用、促进白细胞趋化等先天免疫功能及在干扰素调控过程中有着重要作用（Kim等，2003）。

有报道称，ISG15能保护IFN调节因子3（IRF3）使其免遭病毒蛋白介导的降解，增强抗病毒天然免疫反应（韩军丽等，2007）。

Okumura 等（2006）研究发现，ISG15可以抑制HIV－1病毒的释放，而对细胞内HIV－1蛋白质的合成没有影响。

巴什拜羊属于牛科绵羊属，是被列入中国畜禽遗传资源的
“羔羊肉生产型”的新疆地方优良品种（肯尼·阿尼瓦尔等，1998；决肯·阿尼瓦尔等，2010），具有早熟性好、生长发育快、耐寒、耐粗饲、体质结实、抗病力强
等优点（海拉提·库尔曼等，2011）。

到目前为止，鲜见巴什拜羊ISG15基因相关报道，本试验利用RT－PCR技术从巴什拜羊外周血液淋巴细胞扩增ISG15基因，并进行测序、序列分析，为进一步研究ISG15基因编码蛋白质的功能奠定一定的
基础。

1 材料与方法
1.1材料
1.1.1 试验动物巴什拜羊5只，均来自塔城地区巴什拜羊繁育基地。

1.1.2 试剂及溶剂配制 Trizol购自上海英骏生物技术有限公司（批号:14121），淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司（批号:20110218），cDNA第一链合成试剂盒（批号:J8826）、凝胶回收试剂盒（批号:1101G06）、质粒提取试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司（批号:1011G23），pMD18－T Vector载体购自宝生物工程有限公司（批号:CK5201AA），DNA MarkerⅠ、DNA MarkerⅢ、dNTP、Amp、Taq DNA酶均购自北京天根生化科技有限公司，限制性内切酶HindⅢ、EcoRⅠ购自Fermentas公司，特异性引物由北京六合华
大基因科技股份有限公司合成，Hank’s液、PBS参考分子克隆实验指南配制（萨姆布鲁克等，1570），E.coli DH5α菌株由石河子大学动物科技学院生化实
验室提供。

1.2 方法
1.2.1 引物设计采用Primer Primier 5.0设计引物，以绵羊（FJ844480）的cDNA序列为模板设计引物，预测扩增片段541bp，包括ISG15基因编码区全长522bp，引物序列如下:ISG15F:GAATTCATGGGCGGGGACCTGA；
ISG15R:AAGCTTTTTGCTACAACTTTATTCACTGCG。

1.2.2 淋巴细胞的分离及其RNA的提取取新鲜抗凝血与Hank’s液按1∶1混匀，2mL／管分装于离心管中，待用。

按照淋巴细胞分离液说明书分离淋巴细胞；然
后运用Trizol法提取淋巴细胞总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测巴什拜羊淋巴细
胞总RNA的完整性，RNA纯度通过D260nm／D280nm来确定。

1.2.3 RT－PCR 反转录按照cDNA第一链合成试剂盒说明书进行，反应体系20μL。

RNA模板3.5μL，10μmol／L Oligo（T）2μL，2.5mmol／L dNTP 2μL，RNase－free ddH2O 6μL。

70℃加热5min，冰浴冷却2min后加5×Frist－strand Buffer 4μL，RNase 1.5μL，最后加M－MLV 1μL，42℃50min，
95℃5min终止反应，得到cDNA。

1.2.4 PCR反应体系及条件以得到的cDNA为模板进行PCR，PCR反应体系为
20μL:cDNA模板2μL，dNTP 1.5μL，10×Buffer 2μL，ISG15F 1μL，
ISG15R1μL，Taq 1μL，ddH2O 11.5μL。

PCR反应条件:95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.5 ISG15基因的克隆测序 PCR产物经电泳检测后，按照DNA胶回收试剂盒说明书切胶回收，回收产物与pMD18－T载体连接，转化至感受态细胞DH5α菌，涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养过夜。

挑取白色菌落于LB液
体培养过夜，抽提质粒，经PCR和双酶切鉴定后，阳性克隆菌液送北京六合华大
基因科技股份有限公司测序。

1.2.6 序列分析对测序结果进行BLAST比较分析，应用DNAStar软件根据核苷酸序列及推导的氨基酸序列构建进化树。

2 结果
2.1 淋巴细胞的分离及RNA的检测在分离淋巴细胞的第二层可见环状乳白色淋巴细胞层，收集并获得较纯的淋巴细胞；用紫外分光光度计检测所提总RNA的质量，
D260nm／D280nm＝1.9，证明所提总RNA的质量较好，无降解和蛋白质污染；用1%琼脂糖检测所提RNA，可明显看见两条清晰的条带，分别是28SRNA和
18SRNA（图1），浓度比约为2∶1，说明所提的RNA完整性较好，无DNA污染，可以进行RT－PCR。

2.2 ISG15基因的PCR扩增结果提取的总RNA按照上述条件进行RT－PCR扩增，得到的产物（cDNA）经1.5%琼脂糖凝胶电泳，在541bp有一特异性DNA条带（图2），与引物设计的预期扩增结果一致，证明引物设计及反应条件具有较好的特异性。

图1 巴什拜羊RNA电泳鉴定注:1、2、3均为巴什拜羊RNA。

图2 巴什拜羊ISG15基因电泳图注:1为DNA MarkerⅠ；2、3为巴什拜羊cDNAISG15基因的扩增产物。

2.3 重组质粒鉴定对挑取的白色菌落进行PCR和双酶切鉴定，结果显示重组质粒
中含有预计大小的目的片段（图3、4）。

图3 重组质粒PCR鉴定注:1～4为重组质粒PCR产物；5为DNA MarkerⅠ。

图4 重组质粒酶切鉴定注:1为DNA MarkerⅠ；2、3为重组质粒酶切结果；4为DNA MarkerⅢ。

2.4 目的片段测序结果测序结果得到522bp ISG15基因，用DNAMAN分析碱基组成为A（21.20%）、C（25.63%）、T（18.11%）和G（35.06%）。

其中，
嘧啶碱基（C＋T）占43.74%，嘌呤碱基（A＋G）占56.26%，GC含量为
60.69%。

巴什拜羊ISG15基因测序结果与GenBank参考序列FJ844480相似性为94.48%，在445、484和514bp有3处碱基缺失，多处发生碱基突变（图5）。

巴什拜羊ISG15基因测序结果及推导出的氨基酸序列见图6。

将测序结果在NCBI通过BLAST比对，结果显示，本试验的扩增序列与绵羊（NM＿001009735.1）、山
羊（HQ329184.1）、小尾寒羊（FJ844480.1）、水牛（DQ118136.1）、牛（BC102318.1）和野猪（EU647216.1）的基因序列同源性分别为99%、98%、95%、94%、94%和82%。

并且使用DNAMAN软件推导该蛋白质由172个氨
基酸组成，分子质量是17.434ku。

图5 巴什拜羊ISG15基因序列与参考序列比对注:方框处为突变的碱基，“·”表示碱基缺失。

图6 巴什拜羊ISG15基因测序结果及推导出的氨基酸序列
将克隆得到的巴什拜羊ISG15基因的ORF序列用DNAStar软件分别与牛（Bos tarus）、绵羊（Ovis aries）、小尾寒羊（Ovis aries breed Small Tail Han）、野猪（Sus scrofa）、猕猴（Macaca mulatta）、人（Homo sapiens）、猫（Felis catus）、小鼠（Mus musculus）等动物的ISG15基因的ORF序列进行
同源性分析。

结果表明，巴什拜羊（BA.seq）与绵羊（Ovis aries）、小尾寒羊（Ovis aries breed Small Tail Han）和牛（Bos tarus）的同源性在95%以上，
与野猪（Sus scrofa）、猕猴（Macaca mulatta）、人（Homo sapiens）、鼠（Mus musculus）和猫（Felis catus）的同源性在70%以上（图7）。

据ISG15基因系统发育树可知，巴什拜羊首先与绵羊（Ovis aries）聚为一类，其次跟小尾寒羊（Ovis aries breed Small Tail Han）聚为一类，接下来与牛（Bos tarus）
聚为一类，与人（Homo sapiens）和猕猴（Macaca mulatta）较远（图8），
与实际相符。

图7 ISG15基因的同源性比对结果
图8 ISG15ORF序列与其他物种间的遗传进化树
3 讨论
本试验通过RT－PCR从巴什拜羊外周血中克隆到了ISG15基因，长度为522bp。

初步分析表明，与绵羊参照基因相比，巴什拜羊ISG15基因编码序列有3处缺失，
26处差异，核苷酸序列同源性为94.48%；24处氨基酸差异，氨基酸序列同源性为85.06%。

进一步分析差异基因，在巴什拜羊ORF编码第11位氨基酸的密码子由GGA变为GGG，而导致了氨基酸由天冬氨酸向异亮氨酸转变；编码的第139
位氨基酸的密码子由GGA变为GAA，而导致了氨基酸由甘氨酸向谷氨酸转变；
第418、419和420位，密码子ATA变为TAC，导致了氨基酸异亮氨酸向酪氨酸；第421位和423位编码的第141位氨基酸的密码子由CGG变为GGC，而导致了氨基酸由精氨酸向甘氨酸转变；第427位和429位编码的第143位氨基酸的密码子由CCC变为ACG，而导致了氨基酸由脯氨酸向苏氨酸的转变；由于445位碱
基的缺失导致后面编码密码子改变，相应氨基酸也发生改变，分别为149位到
155位巴什拜羊氨基酸分别转变为缬氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、精氨酸
和亮氨酸；162位到166位巴什拜羊分别转变为丙氨酸、精氨酸、缬氨酸、丙氨
酸和亮氨酸和168位到173位巴什拜羊分别转变为精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、组
氨酸、丙氨酸和丙氨酸。

氨基酸的这些改变，是否会导致蛋白质结构的改变及功能的改变，有待进一步研究。

从遗传演化上分析该基因，巴什拜羊与绵羊、小尾寒羊和牛的同源性在95%以上，与野猪、猕猴、人、鼠和猫的同源性在70%以上，说明ISG15基因在系统发生关系上与各物种间的亲缘关系密切。

本试验并对ISG15基因进行了简单的信息分析，从而对ISG15有了进一步的认识。

然而要更深入的了解ISG15蛋白的结构和功能，还需要对其构建表达载体，以进
一步开展巴什拜羊ISG15的功能研究，揭示ISG15蛋白在免疫中发挥的作用。

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