黄芪甲苷对 CCI模型所致神经损伤修复的机制初步研究

黄芪甲苷对 CCI模型所致神经损伤修复的机制初步研究
褚征;高声传;陈宇峰;王童超
【摘要】大部分镇痛药在很多患者身上有镇痛效果，但是有严重的副作用，因此临床上亟需找到安全有效的能够治疗神经痛的药物。

黄芪桂枝五物汤作为传统治疗药物有一定的治疗效果。

黄芪甲苷为黄芪桂枝五物汤的主要成分，采用SD大鼠，用黄芪甲苷对CCI模型所致神经损伤进行修复治疗，采用免疫印迹和免疫组化等方法，研究细胞损伤修复进展情况。

结果表明，AG能显著下调DRGs中P2X3、TRPA1、TRPV1表达，通过抑制这些在疼痛传递过程中有重要蛋白的表达，从而起到镇痛的作用。

%Most of the pain is in the labor of many patients , but it has serious side effects .Therefore , it is ur-gent to find a safe and effective drug for treatment of neuropathic pain .Huangqi Guizhi Decoction of five ingredients as traditional drugs have a certain therapeutic
effect .Astragaloside as the main component of Huangqi Guizhi De-coction of five ingredients .SD rats were used to repair the nerve injury caused by CCI model .The progress of cell damage repair was studied by using the methods of Western blot and immunohistochemistry .AG could significantly down regulate the expression of P2X3, TRPA1 and TRPV1 in DRGs, which played an important role in the process of pain delivery .
【期刊名称】《科学技术与工程》
【年(卷),期】2016(016)031
【总页数】5页(P146-149,154)
【关键词】黄芪甲苷;CCI模型;P2X3;TRPA1;TRPV1
【作者】褚征;高声传;陈宇峰;王童超
【作者单位】沈阳军区总医院药剂科，沈阳110016;沈阳军区总医院药剂科，沈阳110016;沈阳军区总医院药剂科，沈阳110016;沈阳军区总医院药剂科，沈阳110016
【正文语种】中文
【中图分类】R282.71;R285.5
神经损伤所致的神经痛日益成为世界范围内困扰数百万人的难题，严重影响了患者的日常生活，加剧了患者经济负担。

而很多一线药，如吗啡和非甾体抗炎药等，在很多患者身上镇痛效果并不理想，且副作用明显。

因此，临床上亟需找到安全有效的能够治疗神经痛的药物。

黄芪桂枝五物汤作为传统治疗药物有一定的治疗效果。

其中黄芪甲苷为黄芪桂枝五物汤的主要成分。

大鼠坐骨神经结扎所致的慢性缩窄性损伤模型(chronic constriction injury of the sciatic nerve, CCI)是目前广泛使用的神经病理性疼痛模型之一，部分地再现了神经病理性疼痛的临床表现[1—3]。

1.1 动物
SPF级雄性S-D大鼠(160±20)g购自中国医科大学实验动物中心。

饲养于温度为(21±1) ℃，12 h光照/12 h黑暗(早上7:00光照)的环境中，自由摄取标准颗粒饲料(Purina饲料)，自由饮水，实验前饲养一周以适应环境。

动物实验的所有操作步骤均得到沈阳军区总医院动物伦理委员会的批准。

1.2 试剂
丙烯酰胺、N′, N′-亚甲基双丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、过硫酸铵、SDS
购自北京博普欣生物；蛋白酶抑制剂(抑亮肽酶、抑肽酶、胃蛋白酶、PMSF)：Sigma Inc；β-巯基乙醇购自德国Fluka公司；Tris、甘氨酸、SDS：美国Ameresco公司；封闭用奶粉购自北京普利莱基因技术有限公司；ECL发光试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司；PVDF膜为Millipore 公司产品；蛋白预染Marker购自Fementas；其他各种试剂为进口或国产分析纯试剂。

1.3 仪器
HR-120电子分析天平，日本A&D公司； 2K15型台式低温离心机,美国Sigma
公司；SpectraMax-190型全自动酶标仪，美国Molecular Device公司；pH-211型酸度计，意大利HANNA公司；791型磁力加热搅拌器，上海南汇电讯器
材厂；CU420型电热恒温水箱，上海一恒科学仪器有限公司；DHG-9145A型电
热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；DYY-7C型垂直板电泳转移装置，北京六一仪器厂；TS-1型多用脱色摇床，江苏海门市麒麟医用仪器厂。

1.4 分析软件
凝胶成像分析软件，Image Reader LAS-3000、Multi Gauge，日本富士公司；
酶标吸光度值检测软件SoftMax，美国Molecular Device公司；图像分析软件Gel-pro Analyzer 3.2，美国Media Cybernetics公司。

2.1 蛋白提取及含量测定
(1)给予高剂量AG的大鼠用过量戊巴比妥(300 mg/kg, i.p.)麻醉后，迅速移出同
侧L4～L6背部根神经节(DRGs)。

(2)用匀浆器(Model T10 basic S25, IKA, 德国)将组织蛋白均匀分散于冰冷裂解液
中(10 mmol PMSF，10%甘油，2%SDS和62.5 nmol Tris-HCl，PH为6.8)。

匀浆超声提取1 min。

(3)提取后，匀浆液12000 r/min离心30 min，用BCA蛋白分析试剂盒测定组织
上清液中的蛋白浓度。

(4)参照试剂盒说明书，将BSA(2 mg·mL-1)稀释成一系列浓度梯度的稀释液，用
裂解缓冲液补齐20 μL总体积。

取待测蛋白提取上清5 μL，用裂解缓冲液补齐至20 μL，分别加入96孔板，每个样品坐2个复孔。

将试剂A和试剂B按50∶1的比例配制成工作液，每孔加入180μL工作液，37 ℃放置30 min，冷却至室温，
然后再562 nm下比色测定。

以BSA作为标准蛋白，以蛋白含量(μg)为横坐标，
吸光值为纵坐标，绘制出蛋白标准曲线，根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量(μg)，除以样品稀释液总体积，乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度(μg·mL-1)。

2.2 免疫印迹法(Western blot)
(1)制胶：按照表1配方灌制分离胶，覆盖水压平液面，室温聚合。

弃去上层水相，按照配方在已聚合好的分离胶上方迅速灌入混合均匀的浓缩胶，插入梳子，室温聚合。

(2)将总蛋白量为25.0 g的样品加载在8%或15%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离：按照《分子克隆》所述方法进行蛋白的SDS-PAGE。

电泳结束后，取下凝胶，切
下一角作为标记。

凝胶转移至电转液中平衡。

(3)转膜：PVDF膜以甲醇浸透5 min使用。

将所有用具置于旧电转缓冲液中。

塑
料支架平放，注意黑片(负极)在下，依次放置海绵垫、2层滤纸、凝胶、PVDF膜、2层滤纸、海绵垫，除尽各层间气泡，夹好支架，采用新鲜配制的电转缓冲液在冰浴中进行电转。

电转条件与蛋白的分子量相关，230～240 mA，1.5 h，可有效转移40 kD左右的蛋白，其他蛋白可以此为依据适当调整)，电转结束后，将膜置于去离子水中漂洗，以TBS平衡5 min。

(4)PVDF膜在室温下用5%奶粉和0.1%TBS/T的溶液封闭2 h。

(5)然后4 ℃用抗-TRPA1抗体[anti-rabbit, 1∶500, Abcam (ab68847)], 抗
GFRα1抗体 [anti-rabbit, 1∶500, Abcam (ab8026)], 抗GDNF 抗体 [anti-rabbit,1∶500,Abcam ab18956)], 抗P2X3 抗体[anti-rabbit,1∶500,
Abcam(ab83783)]和β肌动蛋白(1∶80 000, Santa Cruz Biotechnology)冲洗并孵育过夜。

(6)这些印记于室温用辣根过氧化物酶-结合第二抗体(1∶60 000,Jackson Immuno Research Laboratory)孵育2 h。

(7)ECL显色：将ECL试剂盒中Reagent A 与Reagent B等体积混合，按照0.1 mL/cm2滴加在膜上用化学发光及影像分析仪系统内显影并扫描纪录图像。

(8)所有的印记均用Image J 软件 (version 6.0) 分析，通过目标条带和同一泳道β-肌动蛋白结合密度(反应物的‘面积’和‘平均灰度值’)的相对比值来定量。

(9)所有的样品均进行了3次免疫印记试验。

2.3 组织化学分析
(1)各组实验动物麻醉处死后，迅速移出同侧L4～L6的DRGs，并将其置于4%的多聚甲醛中固定，24 h后更换固定液继续进行固定，后行石蜡包埋切片。

(2)将5 μm厚的组织样品切片脱蜡，并于Leica Bond-Max 系统(Leica,德国)中复水化。

(3)抗原修复载玻片在BondTM Epitope Retrieval Solution I中100 ℃加热20 min，用3%的过氧化氢消除内源性过氧化物酶的活性。

(4)一抗孵育：用PBS冲洗3次后，切片用第一抗体室温孵育2 h，第一抗体包括抗GDNF 抗体 [anti-rabbit, 1∶40, Abcam (ab18956)], 抗GFRα1 抗体 [anti-rabbit, 1∶50, Abcam (ab8026)]和抗VR1抗体 [anti-rabbit, 1∶200, Abcam (63083)]。

(5)用PBS冲洗3次后，载玻片用作为第二抗体的多聚抗兔聚-HRP-IgG室温孵育1 h。

(6)抗原复合物DAB染色10 min。

(7)免疫染色后，切片用0.1%的苏木精复染5 min并封片保存。

(8)用不加一抗的切片作为阴性对照。

(9)用配备数码相机的显微镜(BX51, Olympus,日本)观察切片并成像，5组各个切
片的免疫组化染色图像在400×倍率下以盲法随机摄取。

(10)数据用Image-Pro Plus 软件(version 6.0)通过相对阳性面积(相同放大倍数视野下AG和CCI组与假手术组完整组织切片阳性面积的比值)定量。

(11)当切片以抗TRPA1抗体[anti-rabbit, 1∶200, Abcam (ab68847)] 免疫染色
时不进行抗原修复[4]。

苏木素染液配方：
苏木素 1g，无水乙醇10 mL,
蒸馏水 200 mL,钾明矾20 g,
HgO 0.5 g。

先将苏木素溶于无水乙醇中，备用。

把明矾放入蒸馏水，加热溶解，再加入备用的苏木素，煮沸2 min，先加如少量的氧化汞，防止氧化过程中苏木素外淤，玻璃搅拌，然后，边搅拌边加入氧化汞。

加完后，立即放入冰水中，加速其冷却，静置一夜后，过滤。

用前以5%的比例加入冰醋酸。

伊红染液配方：取1 g伊红，溶于99 mL蒸馏水中，即成1%伊红水溶液。

2.4 统计分析
所有数据均以Mean±S.E.M.的形式表示。

各组间差异比较采用SPSS 21.0软件的单因素方差分析(One-Way ANOVA)方法，以P<0.05认为存在显著性差异。

3.1 免疫印记结果
AG能够下调DRGs中P2X3，GDNF，G FRα1和TRPA1的表达。

Western Blot实验结果显示[图1(a)～(f)]，与假手术组相比，从第2天到第23天，
CCI模型组DRGs中的P2X3，GDNF，GFRa1和TRPA1的表达显著上调。

第2
天到第23天，假手术组DRGs中P2X3，GDNF，GFRa1和TRPA1的表达没有
统计学差异。

然而，与CCI模型组相比，AG能下调同一天DRGs中蛋白的表达。

3.2 免疫组化分析结果
AG能下调DRGs中TRPV1，TRPA1，GDNF和GFRa1的表达。

与假手术组相比，同一天CCI模型组DRGs切片中的TRPV1，TRPA1，GDNF和GFRa1表达显著
增加，而且，在第23天，DRGs中有很细胞发生空泡化变性，提示很多DRG神
经元处于坏死过程。

然而，与CCI组相比，AG能降低同一天DRGs中这些蛋白的表达。

另外，在第23天DRGs中的神经元空泡变性较少[图2(a)～(e)]。

明确了HD的作用，我们为了进一步了解其物质基础以及作用机制，我们通过前
期工作和文献调研，对AG的作用机制进行研究，进行了一系列生理生化实验。

P2X3作为一种标志性蛋白，它在CCI术后的中小直径的伤害性敏感神经元中的表达升高，从而进一步引起炎症和组织损伤时内源性ATP及其同类物质的异位敏感
释放[5]。

此外，P2X3有助于LTM神经元中的动力传导。

在Western-blot分析中，从第2天到第23天，AG能显著下调DRGs中P2X3的表达。

这也进一步证
实AG能有效抑制CCI诱导的机械性疼痛。

当结扎部位包含未受损神经纤维的近端神经段暴露于Wallerian变性产生的炎症分子时，这些分子能被完整的传入轴突神经摄取，并逆向转运到DRG神经元，反过来导致TRPV1和TRPA1的易化和上调。

另外，在小直径的肽能伤害感受器中，TRPA1与TRPV1同时高表达[6，7]。

因此，CCI术后的大鼠会产生热和冷痛觉过敏。

Western-blot和免疫组化的数据表明AG能下调 TRPA1和TRPV1的表达，反过来会有效抑制热和冷痛觉过敏。

坐骨神经的慢性压迫可能导致选择性的纤维受损，即压力梯度首先影响大口径纤维，而缺血导致施旺细胞受损。

胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)作为一种分泌蛋白，
CCI术后在施旺细胞中高表达，这可能会促使施旺细胞的增殖和诱导髓鞘形成[8—11]。

随着配体表达的上调，受体的表达也会随之改变。

GFRα1为GDNF的选择性受体，其表达量的高低也与神经痛有重要关系[12]。

总之，在结扎部位近端神经中，大量受损有髓轴突环绕水溶性蛋白GFRα1募集形成的环形束，而AG能通过提高损伤部位水溶性蛋白GFRα1形成环形束，从而提高GDNF的浓度，促进髓鞘形成和轴突修复来达到效抑制神经疼痛作用的。

【相关文献】
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