Smad3磷酸化促进溃疡性结肠炎的黏膜修复

Smad3磷酸化促进溃疡性结肠炎的黏膜修复
陈婷婷;郑丰平;谭嗣伟;陶金;吴斌
【摘要】目的：研究小鼠溃疡性结肠炎黏膜损伤与修复过程及转化生长因子-β（TGF-β）信号转导过程中关键分子Smad3对黏膜修复的作用。

方法给予小鼠3％葡聚糖硫酸钠（DSS）饮用5天诱导急性溃疡性结肠炎，再停用DSS 改为正常饮
水修复。

实验小鼠分为6组，分别为正常对照组，3％DSS 5天损伤期组，饮水修复1、2、3、4周组，其中正常对照组小鼠仅饮用蒸馏水。

观察小鼠结肠炎修复情况及行结肠组织学检查，检测结肠黏膜凋亡与增殖相关指标及TGF-β信号通路中Smad3及相关蛋白的表达，观察其在损伤与修复中的变化。

结果小鼠疾病活动指数在饮用DSS 后上升，修复2周后恢复正常。

结肠组织学评分于饮用DSS 5天损伤期时明显升高，修复2周后下降。

结肠黏膜凋亡指数于损伤期升至最高，至修
复3周后降至正常水平。

增殖指数于损伤期降至最低，至修复3周时升至峰值。

结肠黏膜TGF-β表达量在各实验组均升高，而p-Smad3表达量于损伤期降低，
修复1周后开始上升。

结论TGF-β转导过程中关键分子Smad3的磷酸化促进小
鼠结肠炎黏膜的修复。

%Objective To investigate the process of mucosal injury and repair of ulcerative colitis in mice and the role of p-Smad3 which is the key factor in transforming growth factor-β(TGF-β)signaling pa th-way.Methods Mice were exposed to 3%dextran sulfate sodium (DSS)for 5 days to induce acute ulcerative colitis,then followed with water for 4 weeks for mucosal repair.Mice were divided into six groups:control group that were allowed to drink only water,injury group that were exposed to 3%DSS for 5 days and the other four recovery groups which drunk water for
1 ,2,3,4 weeks after DSS removal,respectively.General health condition was
recorded daily and histological examination was performed to analysis clinical and histopathologi-cal changes of DSS-induced colitis.Related markers of apoptosis and proliferation were detected.The expres-sion of TGF-βand p-Smad3 were measured to observe the change of TGF-
βsignaling pathway during the muco-sal injury and repair process.Results Disease activity index of mice increased after DSS treatment and re-turned to normal at 2 weeks after DSS removal.The histological score significantly increased in injury group and began to decrease after 2 weeks of recovery.The apoptotic index rose to the maximal level in injury group and back to normal at 3 weeks after DSS withdrawal.However,the proliferation index reduced to the minimal level in injury group,then started to increase to the peak at 3 weeks.TGF-βexpression increased in all e xperimental groups,while the activation of Smad3 was inhibited in injury group,then began to be reactivated at 1 week af-ter DSS removal.Conclusion Smad3 phosphorylation promotes the repair of colonic mucosa of ulcerative coli-tis in mice.
【期刊名称】《新医学》
【年(卷),期】2014(000)002
【总页数】7页(P88-94)
【关键词】溃疡性结肠炎;修复;增殖;转化生长因子-β;Smad3
【作者】陈婷婷;郑丰平;谭嗣伟;陶金;吴斌
【作者单位】510630 广州，中山大学附属第三医院消化内科;510630 广州，中山大学附属第三医院消化内科;510630 广州，中山大学附属第三医院消化内
科;510630 广州，中山大学附属第三医院消化内科;510630 广州，中山大学附属
第三医院消化内科
【正文语种】中文
溃疡性结肠炎 (UC) 是一种以直肠、结肠黏膜及黏膜下层慢性非特异炎症为特征的肠道疾病。

目前，对UC的发病机制研究很多，但仍未阐明。

当前的研究表明UC 的发病与环境、遗传、免疫等多个因素有关，特别是与免疫因子异常关系密切[1]。

作为一种多效能生长因子, 转化生长因子-β (TGF-β) 在肠道免疫平衡中发挥着不可替代的作用，其可通过下调过度的免疫应答反应从而抑制炎症的发生与发展[2]。

Smads家族成员是TGF-β下游的信号蛋白分子, Smad3是其关键始动因子。

故本研究建立了小鼠UC模型，试图探索结肠黏膜损伤与修复过程以及Smad3在
TGF-β信号通路中的作用。

材料与方法
一、实验动物
无特定病原体(SPF)级C57BL/6小鼠60只，雄性，周龄8周，体质量20～25 g，购自中山大学北校区动物实验中心。

二、主要试剂
葡聚糖硫酸钠 (MP Biomedicals)、苏木素-伊红染料 (中杉金桥)、TUNEL试剂盒(Roche)、p-Smad3和Smad3抗体 (Cell Signaling Technology)、cleaved caspase-3抗体 (Cell Signaling Technology)、TGF-β抗体 (Abcam)、β-actin
抗体 (Sigma)、Ki67抗体及PCNA抗体 (Santa Cruz)、DAB显色液(DAKO)。

三、实验方法
1.UC小鼠模型建立
小鼠随机分为6组，每组10只。

小鼠自由饮用3%DSS 5 d建立急性UC模型，
后改为饮用正常蒸馏水修复。

分别在3%DSS 5 d，饮水修复1、2、3、4周时处
理小鼠。

2.小鼠疾病活动指数评估
每日观察记录小鼠的状态、饮食、活动、体质量、大便以及死亡情况。

称量体质量，观察粪便性状及粪便隐血情况进行疾病活动指数评分：体质量正常积分为0，体质量减轻1%～5%为1，减轻5%～10%为2，减轻10%～20%为3，减轻大于20%积分为4；大便成形积分为0，糊状/半成形为1，稀便为4；大便潜血阴性积分为0，大便潜血阳性为2，肉眼血便为4。

将三者总分相加，得出每只小鼠的疾病活
动指数[3]。

3.标本采集与处理
10%水合氯醛麻醉后行开腹手术，迅速剖取结肠，沿肠系膜剪开，预冷生理盐水
漂洗后，观察炎症及溃疡情况。

结肠组织放入10%福尔马林中固定制作成石蜡标
本或于冰上刮取结肠黏膜，保存于液氮中，待提取蛋白质。

4.组织学分析
病理标本常规石蜡包埋，HE染色，观察组织学改变并评分[3]。

结肠黏膜组织结构正常积分为0；中度黏膜炎症反应但无糜烂和溃疡积分为1；黏膜炎症反应伴有糜烂积分为2；黏膜炎症伴有小于1.0 mm溃疡积分为3；伴有1.0～3.0 mm溃疡
积分为4；伴有大于3.0 mm溃疡积分为5。

5.TUNEL检测及凋亡指数
参照Roche公司产品说明书进行TUNEL检测，细胞核呈棕褐色为阳性染色。

每
张切片随机选取20个视野，计算凋亡细胞数和上皮细胞总数，凋亡指数=凋亡细
胞数/上皮细胞总数×100%。

6.免疫组织化学染色
Ki67、TGF-β常规免疫组织化学染色，细胞核呈棕褐色为阳性染色。

增殖指数统计：每张切片随机选取100个隐窝，计数Ki67阳性细胞数及隐窝细胞总数，增殖指数=阳性细胞数/细胞总数×100%。

TGF-β信号结果分析：每张切片随机取20个视野，采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件进行结果分析，测量阳性染色面积及平均光密度(以OD值表示)。

7.结肠黏膜总蛋白提取及蛋白质电泳
按照总蛋白提取裂解液说明书提取结肠黏膜组织总蛋白，分离蛋白样品并电泳。

电泳印迹于PVDF膜上，牛奶封闭，相应抗体孵育，暗房曝光。

采用Image J 图像分析软件行条带灰度值分析，以内参β-actin为参照(磷酸化蛋白以对应总蛋白为参照)，计算蛋白相对表达量。

四、统计学处理
采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。

所有计量资料以表示，符合正态分布者多组间比较采用单因素方差分析法，两两比较采用Bonferroni法，P<0. 05为差异有统计学意义。

结果
一、小鼠UC疾病活动指数的分析
小鼠饮用3%DSS 3天时，开始出现体毛凌乱、懒动。

饮用DSS 5天时体质量开始轻微下降，大便不成形，隐血阳性，无肉眼血便。

停用DSS改为正常饮水修复第4天时小鼠状态最差，匍匐不动，体质量降至最低，肛门处有血迹。

然后体质量开始上升，大便性状转好，肉眼血便逐渐消失。

于修复2周时恢复至原始体质量后并继续上升，大便转为正常。

正常对照组体质量则逐步上升，大便正常成形，无肉眼血便，疾病活动指数见图1。

图1 小鼠UC疾病活动指数图损伤期：饮用3%DSS 5 d；修复期：饮用正常水4周。

二、组织病理学的改变
正常组小鼠结肠黏膜结构完整，腺体排列规则，无炎症细胞浸润及糜烂或溃疡(见
图2A)。

损伤期时，可见多灶性小溃疡，隐窝被破坏，腺体正常结构消失，伴有广泛炎症细胞浸润(见图2B)。

修复1周时，黏膜局限灶性糜烂、小溃疡伴邻近上皮
细胞再生，部分腺体开始修复，炎症细胞仍广泛浸润(见图2C)。

修复2周时，广
泛上皮细胞再生，隐窝增生、扭曲变形伴以淋巴、单核细胞为主的慢性炎症细胞浸润(见图2D)。

修复3周时，上皮细胞连续完整，大部分腺体结构完整，少量淋巴、单核细胞浸润(见图2E)。

修复4周时，结肠结构恢复至正常，上皮连续完整，腺
体排列规则，无明显炎症细胞浸润(见图2F)。

对各组小鼠进行组织学评分显示损
伤期组、修复1、2周组评分均高于正常组(P<0.05)，修复3、4周组与正常组无
明显差异，损伤期组与修复1周组差异无统计学意义，而修复2、3、4周组评分
均低于损伤期与修复1周组，具有统计学差异(P<0.05)，见图2。

图2 小鼠结肠黏膜组织学表现及组织学评分(HE染色，×200)A:正常对照组；
B:3%DSS 5天损伤期组；C:修复1周组；D：修复2周组；E: 修复3周组；F:修
复4周组。

*表示与正常组比较差异有统计学意义；# 表示与损伤期组、修复1周组比较差异有统计学意义(P<0.05)
三、结肠组织黏膜凋亡与增殖情况
TUNEL染色显示凋亡信号主要集中于上皮细胞。

损伤期和修复1、2周时，上皮
细胞凋亡较对照组均明显增加(P<0.05)，其中，损伤期时上皮细胞凋亡指数达到
最高值，与各修复组相比均有明显差别(P<0.05)。

修复3、4周时凋亡指数则明显减少，与正常对照组无明显差异，见图3。

结肠增殖情况利用Ki67免疫组织化学
染色，结果显示增殖的细胞主要位于隐窝底部和中部，少量见于上皮细胞和间质炎
症细胞。

损伤期时细胞增殖指数较正常组明显减少(P<0.05)，修复1周时开始上升，至3周时达到峰值，4周时下降恢复至正常对照组水平，见图4。

图3 小鼠结肠黏膜TUNEL染色及凋亡指数(×200)A:正常对照组；B:3%DSS 5天
损伤期组；C:修复1周组；D：修复2周组；E: 修复3周组；F: 修复4周组；*表示与正常组比较差异有统计学意义；# 表示与损伤期组比较差异有统计学意义
(P<0.05)
四、结肠组织TGF-β，p-Smad3及相关蛋白质表达情况
TGF-β免疫组织化学染色显示信号主要位于结肠黏膜固有层炎症细胞。

各实验组TGF-β的表达量均明显增多，于损伤期及修复2周时最高。

阳性信号经相关软件
分析示各实验组表达量均显著高于正常对照组(P<0.05，见图5)。

同时行蛋白质印迹检测，结果显示各实验组TGF-β蛋白的表达量较正常对照组均明显增多，其变
化趋势与免疫组织化学结果一致，而p-Smad3的蛋白质表达于损伤期时显著减少，而修复期重新被激活，修复1周时开始上升，至修复2周达高峰后恢复至正常水平。

促凋亡蛋白caspase-3的激活于损伤期时表达明显上调，此后逐渐下降至正
常水平，而增殖细胞核抗原(PCNA)在损伤期明显被抑制，于修复期逐渐恢复至正
常水平，这与Ki67免疫组织化学染色趋势相一致，见图6。

讨论
UC作为一种慢性非特异性结肠炎疾病，其发病机制尚未明确，目前认为主要与免疫反应异常、遗传易感性、环境及精神等多种因素密切相关[4]。

当前对UC的研
究主要集中在对其发病机制的探索上，而对其病程中结肠黏膜的损伤与修复的过度转化中的机制研究则比较少见。

故本实验采用小鼠自由饮用3%DSS 5天后再改为饮用正常水来探索UC自身修复的组织病理学机制。

实验发现小鼠疾病活动变化情况与组织病理学改变并未完全同步。

在饮用3%DSS 5天时，黏膜损伤严重，但小鼠状态尚可，未出现肉眼血便，体质量轻微下降。

在停用DSS的第4天，小鼠疾
病活动指数最高，此时状态最差，体质量降至最低，肛门处有血迹。

修复1周时，结肠黏膜层仍有大量炎症细胞浸润，但小鼠整体状态则开始出现好转趋势，其体质量开始上升，肉眼血便消失。

修复2周时，虽然肠黏膜并未修复完整，但小鼠体
质量已恢复到原始水平，成形大便多见，修复3周时结肠黏膜基本修复完整。

肠道黏膜上皮细胞增殖分化是一个动态变化的过程, 肠黏膜上皮维持稳定依赖于上皮细胞增殖和凋亡间平衡。

我们前期的研究表明，肠黏膜细胞的凋亡失控是UC导致肠黏膜损伤的主要原因[3]。

本研究中我们发现，小鼠饮用3%DSS 5天时，黏
膜细胞凋亡数达到最高值，而停用DSS后，凋亡细胞数开始减少，至修复3周时
与正常对照组无明显差异。

相关研究表明，UC活动期时，黏膜上皮细胞凋亡速率明显增加, 同时伴随着隐窝细胞过度增殖[5]。

然而本研究通过对增殖抗原的检测，发现损伤期时增殖细胞数明显减少，且此阶段主要是炎症细胞的增殖，但在修复开始第1周后增殖的肠黏膜细胞显著增多并在修复趋于完成时恢复至正常水平，这
些研究结果证明了UC中，肠黏膜细胞增殖数的增加可加快结肠受损黏膜的修复。

图4 小鼠结肠黏膜Ki67免疫组织化学染色及增殖指数(×200)A:正常对照组；
B:3%DSS 5天损伤期组；C:修复1周组；D：修复2周组；E: 修复3周组；F: 修
复4周组。

*表示与正常对照组比较差异有统计学意义；#表示与损伤期组比较差
异有统计学意义(P<0.05)
大量研究表明，组织在免疫损伤、炎症反应到细胞增生等多个环节, 都有赖于各种各样的细胞因子的调控[6]。

其中，TGF-β作为一种具有多种生物学活性的细胞因子，广泛表达于各种免疫细胞，其在细胞增殖、损伤修复、溃疡愈合及免疫调节等方面发挥着重要作用[7]。

早期的研究就表明TGF-β敲除小鼠因出现多系统慢性炎症反应而导致早期死亡，表达TGF-βRII突变体的转基因小鼠在有致病原环境中能自发产生非特异抗原的结肠炎, 而在非致病原环境中对DSS诱导的炎症性肠病易感，导致结肠损伤修复削弱[8]。

在TGF-β信号传导途径中，Smads家族作为TGF-β
下游的重要信号蛋白分子，是将TGF-β信号从细胞外转导到细胞核内的关键步骤,其中尤以Smad3最为重要，其在整个信号通路中发挥着至关重要的作用[9]。

Smad分子表达异常导致TGF-β/Smad信号通路传导障碍使得TGF-β抑制促炎因子活化,维持肠黏膜免疫耐受作用受损进而促进UC的发生发展。

相关研究显示，Smad3基因敲除小鼠受损肠黏膜愈合能力被抑制[10]。

Smad3基因的失控可能是创面愈合延迟、不愈合或过度愈合的原因。

根据以上的资料，本研究中展开了对TGF-β/Smad3信号通路的相关研究，探讨是否TGF-β/Smad3信号通路参与了结肠炎的受损黏膜修复过程。

结果表明TGF-β且呈动态变化，在损伤及修复期均明
显升高，修复1周和修复末期虽然下降但仍高于正常水平，提示TGF-β不仅与黏
膜的损伤有关，并参与了损伤后修复的过程中。

但是其下游的Smad3磷酸化蛋白表达在损伤期明显被抑制，这种现象可能主要是由于损伤期时促炎症蛋白Smad7的过度表达而抑制抗炎的Smad3活化[11-12]。

而修复期的Smad3被明显活化，与隐窝细胞增殖变化趋势相一致，与此同时，上皮细胞凋亡减少，这提示TGF-β
通过激活Smad3磷酸化参与UC黏膜修复过程。

图5 小鼠结肠黏膜TGF-β免疫组织化学染色及其平均光密度值(×200)A:正常对照组；B:3%DSS 5天损伤期组；C:修复1周组；D：修复2周组；E: 修复3周组；F: 修复4周组。

*表示与正常组比较差异有统计学意义; #表示与损伤期组、修复2周组比较差异有统计学意义(P< 0.05)
图6 小鼠结肠黏膜组织相关蛋白质表达情况的检测及灰度比值A:正常对照组；
B:3%DSS 5天损伤期组；C:修复1周组；D：修复2周组；E: 修复3周组；F: 修
复4周组；*表示与正常对照组比较差异有统计学意义; #表示与损伤期组比较差异有统计学意义(P<0.05)
综合上述，本实验通过对UC黏膜损伤与修复过程中组织病理学，细胞凋亡与增殖及TGF-β, p-Smad3相关蛋白的研究来揭示UC的转化发展规律，阐明了TGF-
β/Smad3信号通路在黏膜损伤与修复中的作用，为以后将Smad3作为靶向治疗UC提供了坚实的科学基础。

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