牛肠道疾病的一种新病原鉴定65-PPT课件

• 临床症状：多见于2岁内犊牛，多急性，但也有慢性。
– 急性病期，通常为10～15天，个别1～2天死亡。病初表现为精 神沉郁，被毛松乱，粪便稀薄稍带血液且具恶臭味。一周后， 症状加剧，食欲废绝，消瘦，精神萎靡，喜躺卧，体温上升到 40℃～42℃，瘤胃蠕动和反刍停止，排出带血的稀粪，其中混 有纤维素性假膜，恶臭。病末期粪便呈黑色，几乎全是血液， 体温下降，在恶病质状态下死亡。
• 临床症状：潜伏期短，约为1d左右
– 犊牛腹泻主要见于7～10日龄，吃过初乳或未吃过初乳的犊牛均 可发病，前者病情较轻。病初，患犊精神沉郁，吃奶减少或停止， 排淡黄色的水样粪便、内含凝乳块和黏液，严重的可出现发热、 脱水和血液浓缩。腹泻持续3～6d，大部分犊牛可康复，如腹泻 严重、治疗不适当可能死亡。若继发细菌感染，死亡率可超过50 ％。
• 临床症状：一般为隐性感染，下痢、肺炎、呼吸道症状和乳房炎较为 常见。此外，繁殖障碍表现明显，如子宫内膜炎、不孕、流产和死胎。 但大多数情况下，BEV一般为无症状感染，不会导致患畜健康严重受 损。试验感染时，动物表现为轻度下痢和轻微呼吸道症状。下痢表现 为水样腹泻，有泡沫，少数严重的还有鲜血。体温变化不明显，食欲 下降，基本没有死亡，但产奶量大幅下降。约两周后康复，康复后大 多数奶牛的产奶量不能恢复到病前的水平。
• 病程两周左右，康复后大多数奶牛产奶量 难以恢复到病前水平，特别是高产奶牛。 据回顾性调查，该病两年发生一次。发病 牛场采样分离到了一种牛肠道病毒。
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目的意义
• 本研究通过从临床上严重腹泻、血性下痢病牛直肠拭子中 分离的一株牛肠道病毒2型分离株鉴定过程，介绍一种基 于随机PCR 的未知病毒鉴定方法，为后期未知病原体分 离鉴定奠定基础，同时也为牛肠病毒2型感染的诊断和控 制提供了科学依据。
死率增高。
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牛病毒性腹泻-黏膜病
• 流行病学：各种年龄都易感、以幼龄牛易感性最高。病牛 分泌物、排泄物、血液和脾脏等都含有病毒，主要传播途 径是消化道和呼吸道，也可经胎盘垂直传播。以冬春季节 多发。新疫区急性病例多，病死率可达90%～100%，老 疫区急性病例少，但隐性感染高达50%以上。
• 临床症状：潜伏期7～14天。临床上牛群多数表现为隐性 感染，但小牛症状严重。
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牛轮状病毒病
• 流行病学：1～7日龄ห้องสมุดไป่ตู้新生犊牛。患病动物和隐性感染 者是主要传染源。污染的饲料、饮水、垫草及土壤等媒介 经口传播。多发生在晚秋、冬季和早春。寒冷、潮湿、不 良卫生条件、劣质饲料和其他疾病的等均对该病严重程度 和病死率影响很大。
• 临床症状：最早病例见于生后12小时，最迟也在数周以
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牛大肠杆菌病
• 流行病学：病原存在于成年牛肠道和周围环境。消化道传 染，也可经脐带感染。该病多见于初生犊牛，尤其2～3 日龄犊牛最为易感，故又成为犊牛白痢。
• 临床症状: 潜伏期短，一般为几小时至十几小时。
– 败血症型 产后3天内犊牛。病初体温升高至40℃，食欲降低或废 绝，随后腹泻，很快脱水，数小时至1天内因急性败血症死亡。 病死率可达80％以上。病程稍长者，可能并发脐炎、关节炎或肺 炎，幸存者生长发育受阻。
– 成年奶牛可发生血痢，特征为突然发病，表现腹泻，便如黑血样， 产奶量急剧下降，同时出现流鼻涕、咳嗽、精神沉郁和食欲不振， 发病率可达50％～100％，但死亡率很低。
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牛肠道病毒感染
• 流行病学：牛肠病毒广泛存在自然界，主要流行肠病毒1型和2型。 BEV-1宿主范围包括人、马、狗、牛、猪、兔、禽类、鹿、非洲羚羊、 水牛、绵羊和山羊；BEV-2的宿主只有家养牛。在国外牛群中，牛肠 病毒阳性率高达到17.6-80%。初生犊牛因饮用初乳导致抗体阳性率 非常高。主要经过粪口途径传播。病毒在宿主的消化道中复制增殖。 病毒对酸性环境耐受的特性使得病毒能在消化道中长期存活。感染动 物粪便中存在相当高的滴度（105-1011/g）的病毒粒子。
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牛沙门氏菌病
• 流行病学：各种年龄，但幼龄更易感，以2～6周龄犊牛易感 性最高。妊娠可流产。患病动物和带菌者是主要传染源。一 年四季均可发生。呈散发或地方流行性。
• 临床症状
– 急性型：突然发病、高热（40～41℃）、精神沉郁、食欲废绝、产 奶量下降。不久即开始下痢，粪便呈水样，恶臭，带血或含有纤维 素絮片。下痢开始后体温降至正常或略高。病程持续4～7天。不经 治疗或治疗不当死亡率可高达75%，而经治疗后，死亡率可降至 10%。病牛表现毒血症症状，脱水、消瘦。持续10～14天粪便稀软， 一般需2个月才能完全康复。妊娠母牛感染后可发生流产。
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病毒分离结果
正常细胞形态及感染后不同时间点的细胞病变
正
常
8h
细
胞
16h
36h
× 400 16
1、 蚀斑纯化和病毒增殖 利用MDBK细胞，按照蚀斑纯化常规方法，将分离物进行纯化。
将经过三次纯化的未知病毒再次接种细胞单层，37℃作用1h，弃病 毒液，加含1%FBS的DMEM，于5%CO2培养箱培养观察记录细胞病 变（CPE）。至CPE出现90%左右，收获病毒液。连续传毒3代后大 规模增殖病毒。
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牛弯曲菌性腹泻
• 流行病学：又名牛冬痢或黑痢，秋冬季节，出血 性下痢。各品种和年龄均可发病，一般成年牛发 病较重，犊牛则较轻。地方流行性。病后可获得 一定的免疫力。
• 临床症状： 潜伏期为3～7天，突然发病，一夜间 可蔓延20%牛群，2～3天可波及80%牛群。病牛 排出恶臭水样稀粪，常带有血液。体温、脉搏、 呼吸、食欲正常。病情严重者，表现精神萎顿， 食欲不振，弓背寒战，虚弱无力。病程2～3天， 治疗及时，很少发生死亡。
• 临床症状：食欲下降、腹泻、脱水是本病的主要特征。 若单独感染腹泻可持续7天以上，继发感染或者混合感 染则会出现脱水、酸碱失衡、腹泻等。犊牛感染最为严 重，主要表现精神沉郁，厌食，腹泻，粪便带血和含大 量纤维素；发育迟缓，进行性消瘦和减重甚至死亡。其 中鼠隐孢子虫可引起中等程度的腹泻，小隐孢子虫可引 起水样腹泻。
– 肠毒血症型 生后7天内犊牛，通常不出现明显症状突然死亡。有 症状者则为典型中毒症状，如体温正常或稍高，初期兴奋不安， 随后转为沉郁甚至昏迷，然后进入濒死期。死前伴有剧烈腹泻， 排出白色而充满气泡的稀粪。
– 肠炎型 7～10日龄犊牛，体温升高、食欲减退、喜躺卧，下痢， 粪便初呈黄色粥样，随后变为水样、呈灰白色，并混有未消化的 凝乳块、血液、泡沫，有酸败气味。后期病犊排粪失禁，尾和后 躯染有稀粪。病程长的，可能出现肺炎或关节炎。治疗及时，一 般可以治愈。如不及时治疗，常因虚脱或继发肺炎而死。个别病 例也会自愈，但以后发育迟缓。
内终止。人工感染潜伏期是18～24 小时。症状以突然腹
泻开始，病犊精神萎顿，体温正常或略有升高。若体温降
至常温以下则是死亡的征兆。厌食和腹泻，粪便黄白色液
状，有时带有粘液和血液。腹泻时间延长，则脱水明显。
病死率可达10～50%，死亡的原因多是急性脱水或酸中
毒。病程1～8天。若继发感染大肠杆菌则预后不良，致
牛球虫病
• 流行病学：各品种，2岁以内犊牛发病率较高，死亡率 20%～40%，而成年牛常呈隐性感染。一般多发生在49月份。潮湿多沼泽草场放牧牛群很易感染。冬季舍饲 期间亦可能发病，主要由于饲料、垫草、母牛乳房被粪 污染，使犊牛感染。牛群拥挤和圈舍卫生条件差时会增 加发病机会。不同地区，不同牛群的球虫感染率及发病 率不同。
– 犊牛 有些犊牛在生后48小时内开始拒食、卧地，并迅速出现衰竭等 症状，常于3～5天内死亡。但多数犊牛则于10～14日龄后发病，体 温升高（40～41℃），24小时后排出灰黄色液状粪便，并混有粘液 和血丝，通常于发病后5～7天内死亡，病死率可达50%。病期延长 时，腕和跗关节可能肿大，有的还有支气管炎和肺炎等症状。
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• 牛肠病毒（Bovine Enterovirus）为小RNA 病毒科成员。
• 无囊膜，直径为27-30nm。复制部位在胞浆， 往往可见晶格样排列的病毒颗粒。
• 被黏膜或粪便包裹的病毒在通常的环境下对 热稳定。对pH3及高盐环境耐受，对消毒剂 不敏感。
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• 近年来北京部分牛场的产奶牛普遍（约 80%）出现严重腹泻症状：水样腹泻，有 泡沫，少数（10-15%）严重病牛粪便含有 鲜血，体温变化不明显，食欲下降，基本 没有死亡，但产奶量大幅下降（约30%）。
– 慢性病例，病程长达数月，主要表现下痢和贫血，如不及时治 疗，亦可发生死亡。
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牛隐孢子虫病
• 流行病学：粪-口途径感染，宿主范围广泛；发病率很 高但死亡率差别很大。100日龄以内幼畜尤其4～30日 龄犊牛最易感染。国外报道犊牛(4-17日龄左右)发病率 达50%以上，国内在北京、湖南、河南等省市调查的感 染率为5.3%-40%，牛病程2～14天，死亡率16%～ 40%。
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1、病毒浓缩 在收集到的病毒上清中加入5％的PEG 6000，4 ℃搅拌过夜（约18 h）。
4 ℃ 10000 rpm离心1.5 h，弃上清。沉淀用TNMC缓冲液（50 mM TrisHCl，pH 7.5，100 mM NaCl，10 mM CaCl2，1mM MgCl2）悬浮，于4 ℃ 50000 rpm离心1 h，弃上清。沉淀用TNMC缓冲液重新悬浮，使其终体积 为浓缩前的1%。
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牛副结核
• 流行病学：副结核分枝杆菌主要感染牛，特别幼年牛更易 感染发病。病牛和隐性感染牛是传染源，流行特点是发展 缓慢，病程长、发病率不高、病死率极高，一旦在牛群中 出现则很难根除。怀孕、分娩、泌乳或营养缺乏等因素可 促使发病。
• 临床症状：潜伏期长达6～12个月，甚至更长。有的幼年 牛感染，到～5岁时才表现临床症状。病初往往无明显症 状，以后症状逐渐明显，出现间歇性腹泻，逐渐变为经常 性的顽固腹泻。粪便稀薄，恶臭，可带有气泡、粘液和血 液凝块。早期食欲、精神都还正常，以后食欲减退，逐渐 消瘦，眼窝下陷，经常躺卧，不愿走动。皮肤粗糙，被毛 粗乱，下颌及垂皮水肿。体温常无明显变化。如给予多汁 饲料可加重腹泻症状。如腹泻不止，一般经3～4个月， 最后因腹泻衰竭而死。患病牛群因本病的死亡率可达10%5。
– 急性型 常见于幼犊，死亡率很高，腹泻是特征性症状，可持续 1～3周。稀粪呈水样初期淡黄色，后期常伴有肠粘膜和血液，水 样、恶臭，有大量粘液和气泡。体温升高达40～42℃，流鼻汁、 咳嗽、呼吸急促、流泪、流涎、精神萎顿等，以后口腔粘膜发生 糜烂或溃疡持续4～7天，同时白血球减少。
– 慢性型 出现间歇性腹泻，病程较长，一般2～5个月，病牛被毛 粗乱、消瘦，生长发育受阻，有的出现跛行。
牛腹泻类疾病概述
• 临床上牛肠道疾病包括传染性疾病和非传染性疾病，病因复 杂，是严重制约我国养牛业发展的一个重要的因素。
• 由传染性因素所致的牛肠道传染病-腹泻，其病原多样，临床 上以严重腹泻、脱水和高度死亡为特征。
• 常见腹泻类疾病主要有沙门氏菌病、大肠杆菌病、牛副结核 病、牛弯曲菌病、球虫病、隐孢子虫病、牛病毒性腹泻、牛 细小病毒病、牛轮状病毒病、牛冠状病毒病等。
2 、牛肾细胞（MDBK）TCID50测定 在96孔细胞培养板上培养BK细胞至单层后，吸弃培养液，分别
接种增殖后的原液细胞毒和10-1~10-7稀释病毒液，病毒稀释液为基 础培养基。对照组用基础培养基代替病毒液。每孔100µl，每组10孔， 于CO2培养箱孵育1h。吸弃接种液，每孔加125 µl DMEM维持液， 于CO2培养箱培养3d，观察细胞病变情况。
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病料采集和病毒分离
• 采集病牛直肠拭子，按常规方法处理备用。 • 培养MDBK细胞，待细胞单层生长至80%
以上时，将处理后的病料接种到MDBK， 37℃作用1h，弃病毒液，加含1%FBS的 DMEM，于5%CO2培养箱培养观察记录细 胞状况，当出现细胞病变（CPE）时收获 病毒液，并连传3代制备毒种。
– 妊娠母牛常发生流产，或产下有先天性缺陷犊牛。最常见的缺陷
是小脑发育不全。患犊表现轻度的共济失调、完全不协调或不能
站立。有些患牛失明。
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牛冠状病毒病
• 流行病学：多见于1～9日龄乳用犊牛，肠炎严重程度与 犊牛日龄、免疫状况、病毒毒株和感染剂量有关。常呈地 方流行性，发病牛场常在几年内连续发生。消化道和呼吸 道是主要传播途径。饲养管理差、寒冷、潮湿可促使本病 发生。