分子实验 质粒的提取、纯化及检验

大肠杆菌（E.coli）质粒DNA的提取、纯化及检验
【实验目的】
1.了解有关质粒的特征和作用；
2.学习并掌握有关质粒提取和纯化的原理及方法；
3.学会用琼脂糖凝胶电泳法对实验结果进行分析。

【实验原理】
质粒（Plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，广泛存在于原核生物中，在部分真核生物中也存在。

治理具有以下性质：
（1）质粒不是细胞生长繁殖所必需的遗传结构。

质粒可以从细胞中消除而不影响细胞的生长，但质粒的存在往往赋予寄主细胞一定的生理功能，如抗生素性、重金属性及产生细菌素等。

（2）质粒在细胞内以共价闭合环状DNA（covalelltly closed circular DNA，简称cccDNA）形式存在，呈超螺旋状态。

在质粒提取过程中，由于机械外力的作用，质粒的天然超螺旋结构遭到破坏，如果一条链保持完整的环状结构，另一条链有一个或多个缺口时，称为开环DNA（open circular DNA，简称ocDNA)；若双链DNA均发生断裂，则称线状DNA（linear DNA，简称LDNA）。

不同构型的质粒DNA，尽管相对分子质量相同，但电泳迁移速率不同，因此可以通过琼脂糖凝胶电泳或氧化铯密度梯度离心将其分开。

（3）自主复制，在细胞分裂时恒定的传递给子代细胞。

也有些质粒可以整合到染色体上，并随染色体一起复制，这样的质粒称为附加体（episome）。

（4）不同的质粒在细胞中的拷贝数不同。

细胞中含有1-3个拷贝的质粒为低拷贝质粒，属于“严谨型复制”；当质粒数在10个拷贝以上时，属于“松弛型复制”，用于载体构建的质粒多为松弛型。

本实验采用碱变性法提取大肠杆菌pUC19质粒DNA，碱变性法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。

在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链相互盘绕，仍会紧密的结合在一起。

当加入PH4.8的乙酸甲高盐缓冲液回复pH至中性时，共价闭合环的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复兴迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已经完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，同构离心，染色体DNA与不稳定的大分子DNA、蛋白质SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

DNA分子在琼脂糖凝胶电泳中泳动时有电荷效应和分子筛选效应。

DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以相同的速度向正极方向移动。

在一定的电场强度下DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和结构。

具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。

DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。

凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但结构不同的DNA分子。

如质粒的3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA（cccDNA）；开环质粒DNA（ocDNA），即共价闭合环状质粒DNA的一条链断裂；线状质粒DNA（LDNA），即共价闭合环状质粒DNA的两条链发生断裂。

这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移速率不同。

因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的
为开环质粒DNA。

此法的三个步骤为：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。

【实验器材】
菌种
E．coli DH5α受体菌，具有Amp’标记的质粒pUC19
仪器和材料
恒温振荡培养仪，高速冷冻离心机，旋涡振荡器，冰箱，移液枪，分析天平，高压灭菌锅，水浴锅，琼脂糖凝胶电泳系统，1.5ml离心管，50ml离心管，不同型号的枪尖，10ml移液枪，100ml和300ml锥形瓶
LB培养基
蛋白胨1％，酵母粉0.5％，NaCl 1％，葡萄糖1％，pH7.0-7.4
试剂
溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ
溶液Ⅰ：葡萄糖50mmol/L，EDTA 10mmol/L，Tris-HCl 25mmol/L，pH至8.0。

可一次配制100ml，在1.05kg/cm2高温高压蒸汽灭菌15min，4℃保存。

溶液Ⅱ：NaOH 0.2mol/L，SDS 1％（临用前用10mol/LNaOH 和20％SDS母液配制）。

溶液Ⅲ：取5mol/L乙酸甲60ml，冰乙酸11.5ml，混合后ddH2O至100ml，保存于4℃，溶液终浓度为：钾离子3mol/L，乙酸根离子5mol/L。

1M Tris-HCl（pH7.5）、RNaseA母液、酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）、TE（pH8.0）、Tris水溶液饱和酚、预冷无水乙醇、TBE电泳缓冲液、上样缓冲液、0.25％溴酚蓝、40％蔗糖水溶液、溴化乙淀溶液（0.5ug/ml）、琼脂糖、氨苄青霉素
【实验步骤】
一、配置培养基
LB培养基：每1000ml加NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖10g，用蒸馏等会配制，再用10M NaOH调pH至7.5。

在两个锥形瓶中分别加入20ml和50ml的培养液，高压蒸汽灭菌备用。

二、质粒的扩增、提取和纯化
1.培养细菌以扩增质粒
将导入pUC19质粒的大肠杆菌在含有氨苄青霉素的培养基中培养，已筛选出成功导入目标质粒的菌种。

挑取含有目标质粒的菌种于100ml锥形瓶中，加入100ug的氨苄青霉素（培养时氨苄青霉素的有效浓度为50-100ug/ml，本实验中取100ug/ml，从而以免培养过程中由于挥发导致氨苄青霉素浓度过低），37℃摇床过夜培养；然后取2-3ml 菌液于300ml锥形瓶中，加入250ug 的氨苄青霉素，37℃摇床培养4-6h，以扩增质粒。

2.收集和裂解细胞、粗提质粒
步骤现象说明
将培养得到的细菌悬浮液倒
入称重好的50ml离心管（m=14.255g），用分析天平和12组的离心管配平，7000rpm 离心5min。

在离心管底部出现了白色沉
淀
使菌体沉淀
弃上清液，加5ml溶液Ⅰ，
打散菌泥洗涤，用溶液Ⅰ配平，同上离心，干燥，称重（m’=14.440g）离心管底部有白色沉淀
溶液Ⅰ使细胞悬浮，洗涤所得
菌体，并且EDTA可以与Ca2
和Mg2+螯合，抑制DNase的
活性。

根据计算菌泥质量为
14.440—14.255=0.145g，即可
以看做200mg
每100mg 菌泥加溶液Ⅰ1ml，打散混匀，冰水浴5min 成悬浊液悬浮分散细胞；冰水浴的作用
是降低细胞中酶的活性
每100ml菌泥加溶液Ⅱ2ml，轻加轻摇可以看到溶液由浑浊稀薄变
得浓稠
使菌体破壁，细胞壁破裂，内
溶物散出；使细胞中的蛋白质
与SDS结合成复合物，便于
下一步离心除去。

（溶液Ⅱ为
强碱性溶液，染色体DNA氢
键断裂，双螺旋结构开旋而变
性；共价闭合环状的质粒DNA
大部分氢键断裂，但其超螺旋
结构的两条互补链不完全分
离）
每100mg菌泥加溶液Ⅲ
1.5ml，轻加轻摇，冰水浴10min 有白色絮状物析出
使质粒DNA溶解在上清液
中，核染色体DNA沉淀。

（溶
液Ⅲ为高盐溶液，中和碱性溶
液至中性，使变性的质粒DNA
复性并溶解到溶液中，而和染
色体DNA复性时，由于庞大
而互相夹缠纠结成网状结构
而析出，沉淀在离心管底部）
至此，大分子蛋白质、糖类、
染色体均变成了沉淀
配平，12000rpm，离心15min，
将上清液轻轻转入新管，加0.1倍体积的3mol/L 的NaAc，混匀澄清溶液变浑浊，试管底部出
现白色沉淀
使NDA、RNA以及SDS蛋白
质复合物凝聚而沉淀（高浓度
的钠盐能够中和核酸上的电
荷，减少相互斥力而互相聚
合，钠盐与SDS-蛋白复合物
作用后，能形成较小的钠盐的
复合物，使沉淀更完全）
加入2倍体积的冰无水乙醇，混匀，—20℃沉淀30min 白色沉淀进一步沉淀质粒DNA（乙醇
可以任意比和水相混溶，而不
会与核酸起任何化学反应，对
DNA很安全，因此是理想的
沉淀剂。

DNA溶液是DNA以
水和状态稳定存在）
12000rpm 离心5min，弃上
清液，加入3ml 70％的乙醇，
不打散沉淀洗涤一遍
白色沉淀洗去残余的盐分
12000rpm 离心5min（注意离心管放入离心机的位置—
有沉淀的一面朝上），弃上清液，倒扣干燥，用枪尖吸取1ml TE溶液溶解沉淀，轻轻吹打助溶，转移至灭菌的1.5ml 的Eppendorf管中白色沉淀溶解在te溶液中
溶解回收DNA（采用Tris-HCl
缓冲溶液，不存在金属离子的
干扰作用，而TE缓冲溶液中
的EDTA更能稳定DNA的活
性）
注意：吹打时注意不要注入空
气，尽量减少起沫，泡沫过
多会使提取有损失。

3.质粒纯化
步骤现象说明加入RNase A（c=10mg/ml），
使溶液最终浓度为50ug/ml，37℃水浴0.5—1h后，平分到两个1.5ml的Eppendorf管中无明显变化
RNase A 可以酶解除去提取
物中的RNA
加入等体积的Tris饱和苯酚溶液，混匀，7000rpm离心5min，将上清液转移到新管管中溶液呈三层，最上层澄清
透明，中间层为乳白色沉淀，
最下层为黄色
质粒溶解在最上层。

（苯酚是
有机溶剂，非极性，可使蛋白
质失水变性，析出进而沉淀，
且本溶液中含有δ—羟基喹
啉，不仅能够抗氧化，并在一
定程度上能抑制DNase的活
性。

因为酚与水有一定的互
溶，酚用水饱和的目的是使其
抽提DNA过程中不致吸收样
品中含有DNA的水分，减少
DNA的损失。

用Tris调节至
pH为8是因为DNA在此条件
下比较稳定。

在中性或碱性条
件下（pH5-7），RNA比DNA
更容易游离到水相，所以获得
RNA含量较少的DNA样品。

）
注意：操作时要用枪轻轻吸取
最上层的水相，不要扰动中间
的白色蛋白层。

加入等体积的Tris水溶液饱和酚与氯仿的1:1溶液，混匀后，7000rpm离心5min，将上清液轻轻转入新管溶液分三层，上层澄清透明，
中间层有少量白色蛋白层，最
下层是苯酚层
进一步纯化DNA。

苯酚的变
性作用很大，但酚与水相有一
定程度的互溶，大约10％
-15％的水溶解在酚相中，因
而损失了这部分水相中的
DNA，而氯仿与水不相混溶，
不会带走DNA。

所以混合使
用酚与氯仿效果最好。

氯仿中
含有异戊醇，能降低分子表面
张力，所以能减少抽提过程中
的泡沫产生。

一般采用氯仿与
异戊醇为24:1之比。

也可用
酚、氯仿与异戊醇之比为
23:24:1，同时异戊醇有助于
分相，在离心后的上层水相、
中层变性蛋白相以及下层有
机溶剂相维持稳定。

加入等体积的氯仿溶液，混
匀后，7000rpm 离心5min，
将上清液轻轻转入新管，上清液加入0.1倍体积的3mol/L的NaAc，混匀，再加入2倍体积的冰无水乙醇，混匀，—20℃沉淀30min以上溶液分为两层，中间的蛋白层
不见
将纯化好的DNA提取出来
12000rpm离心15min，弃上
清液，加入500ul 70％乙醇，不打散沉淀洗涤一遍。

12000rpm 离心5min 白色沉淀
用乙醇洗去残余盐分（注意离
心位置不变）
弃上清液，倒扣干燥后，用枪吸取30ul TE溶液溶解沉
淀，轻轻吹打混匀后，转移至另一含有质粒的Eppendorf 管中，再用枪吸取20ul TE溶液加入管中，使沉淀完全溶解乳白色沉淀渐渐溶解将已经纯化的DNA溶解在TE
溶液中
4.质粒检测
步骤说明
称取0.32g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入40ml
1ⅹTAE缓冲液，置于微波炉上加热至完全融
化，取出摇匀
配制琼脂糖凝胶
取干净的有机玻璃内槽，置于胶盒中，放于
水平位置，并放好样品梳子。

将冷却到60℃
左右的琼脂糖凝胶液缓缓倒入有机玻璃内
槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面
（注意不要形成气泡）。

待胶凝固后，取出梳
子，将胶轻轻置于含有电泳缓冲液的电泳槽
内
如果胶板上出现气泡，则用移液枪轻轻吸走
用移液枪取5ul 质粒样品与3ul 电泳载样液吹打均匀，将已加入电泳载样液的质粒样品加入点样孔点样
注意：在吹打混匀的过程中要尽量轻柔，不要产生气泡。

移液枪要竖直，枪尖插入凝胶孔中。

接通电泳槽与电泳仪的电源，当蓝色条带移到距凝胶边缘1-2cm 处关掉电源，停止电泳电泳
注意正负极，DNA片段从负极向正极移动
将电泳后的凝胶浸入溴化乙淀溶液，染色染色
3-5min
注意溴化乙淀为致癌物，必须戴三层一次性塑料薄膜手套操作，并小心不要污染环境，不要戴手套碰触其他仪器。

【实验结果】
凝胶电泳图如下：
12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2
1 Hind Ⅲ 标准pUC19
电泳结果：
最右边的竖带是标准pUC19的条带，用以对照估算所提取的质粒DNA 的浓度；紧挨着的是Hind Ⅲ酶切片段的条带，用以对照判断DNA 的分子量；剩下的依次是各个小组点的样带，竖带11是我们组的。

a 为点样孔，发亮，说明有少量的杂蛋白残留在点样孔内，发红是因为曝光过度。

b 为染色体DNA 的片段，说明溶液Ⅱ、溶液Ⅲ未使染色体DNA 充分变性。

c 共价闭合环状DNA 的一条链发生了断裂，不明显；
d 为线状DNA ，即共价闭合环状DNA 的两条链发生了断裂，很明显。

说明在混合的时候动作不够轻柔，是超螺旋DNA 发生了断裂。

e 为超螺旋的共价闭合环状质粒DNA ，即本次实验所需提取的目的物。

f 为RNA 条带，不明显。

【结果分析】
1.DNA 的琼脂糖凝胶电泳时，点样一般要快，否则样品就会出现扩散，影响实验结果。

横向比较各组的条带，都有不同程度的扩散现象。

2.我们组的竖带中有残余的白色物质，说明去除杂蛋白不够彻底，有微量残余。

这可能是在转管中不小心将部分蛋白质带进DNA 样品中造成的。

3.b 处的染色体DNA 带稍微明显，可能原因有：一是染色体DNA 未完全变性；二是在
a b c d e f
加入溶液Ⅱ、溶液Ⅲ时不够轻柔，使染色体破碎成片段，沉淀不完全。

4.d处的线状DNA带比较明显，并且较宽，可能是断裂的DNA片段造成的。

说明在提取质粒的过程中质粒DNA发生断裂，可能是由于在加入溶液时动作过大，发生震荡，使质粒DNA受力而开环或断成片段。

5.e带最为明亮，这正是我们这次实验的目的物——超螺旋的共价闭合环状质粒DNA。

6.f带并不明显，只能略微看出来，说明RNA的酶解基本彻底。

7.所提取的质粒DNA浓度估算：
从电泳图可以看出，我们组cccDNA 带的亮度是pUC19 cccDNA带的2倍，故，C=(2*200)*10-3/3=0.133ug/ml
【结果讨论与反思】
在粗提质粒的过程中，要用乙醇不打散洗涤质粒沉淀，以洗去表面的盐分，虽然我们组在操作过程中沉淀有一些散，但并没有对实验结果造成太大影响，主要是可能是由于乙醇与核酸不会起反应。

由实验结果可以看出，线状DNA的量有些多，这是由于实验过程中操作不够准确、仔细造成的。

在今后的分子实验中要多加注意溶液用量的准确性以及动作的标准性。

在点样过程中，吹打样品是要注意不要出泡沫。

我在开始操作时，由于移液枪的使用不对，混合液滴出现了很多小泡；第二次操作动作规范了，移液枪竖直拿着，枪尖不离开小液滴进行吹打，成功点了样。

在实验操作中要做到心中有数，弄清楚每一步骤的原理，仔细听老师讲课，熟悉一些实验操作技巧，避免不该犯的错误。

【思考题】
1.碱变性法提取质粒DNA时，获得高质量质粒DNA的关键步骤有哪些？
答：关键步骤是加入溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的处理步骤，还有加入Tris水溶液饱和酚离心的步骤，因为这几步分别是使质粒DNA与染色体DNA以及蛋白质分离的步骤。

2.碱变性法提取野生菌种的质粒DNA时，如果在琼脂糖凝胶电泳胶板上出现了5条带，
则说明该菌株有5个质粒。

该结论对吗？怎样验证？
答：不对。

这5条带除了是质粒DNA外，还有可能是断裂的质粒DNA片段，也有可能是染色体DNA的片段。

可以小心重复操作几次，看看条带会不会减少。

如果是由于试剂或者仪器的原因所造成的提取质粒DNA的不纯，这种方法则不可行。

那可以用限制性内切酶处理，通过条带的改变来判断质粒DNA的改变。

但是由于该菌株是野生郡主，不确定其质粒DNA 的限制性内切酶的没切位点，需要大量尝试才能得出结论。

可以对电泳胶板上的条带DNA回收，再做核算分析即可。

3.在提取的质粒DNA中，含有大量没有去除干净的RNA，可能原因是什么？怎么解决？
答：是由于RNA酶解不够彻底造成的。

有可能是酶的作用时间不够长，或者酶本身活性不是很高，或者在酶作用时没有让底物与酶充分接触。

因该换用活性较高的酶，延长作用时间，并且充分震荡试管（在保证不使DNA断裂的前提下），使酶与底物充分接触。