牛产气荚膜梭菌的分离与鉴定

牛产气荚膜梭菌的分离与鉴定
针对南阳市牛猝死的现象，采集20头病牛的病料进行细菌分离培养。

从菌落、菌体的形态、细菌生化特征、动物试验、细菌动力学试验等方面对病牛病原菌进行了鉴定。

结果表明，病原菌为革兰氏阳性粗短杆菌，严格厌氧，β-溶血，能发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和含铁牛乳；厌气肉肝汤培养物滤液0.1～0.2ml 注射可致小白鼠死亡。

根据实验结果鉴定其为产气荚膜杆菌。

标签：牛；猝死；产气荚膜杆菌；鉴定
多年来，南阳市某些县市区发生不明原因的牛猝死现象。

根据不完全统计，2005～2008年，因该病死亡的牛256头，农民的生产生活受到严重影响。

该病特征为发病急，死亡快，病死率高，病死前2～3天未见异常，一旦发病，1～2h 内死亡，病死率100%。

至今未见感染其他动物或人。

此病仅局限于一个村或几个相邻几个村，未见迅速向周边地区扩散。

牛死后腹部高度膨胀，自然孔不出血。

剖检时见肉质与正常屠宰牛无异，但肠黏膜严重出血，肠内容物呈番茄汁状，空肠最明显；喉头、气管黏膜呈点状、片状出血；胆囊黏膜、心外膜及心内膜有不同程度的出血点或出血斑。

其他器官未见异常。

根据病牛的临床症状、剖检病变、治疗效果等，笔者怀疑病是由细菌病毒引起的牛急性中毒。

此后，笔者在病情严重的唐河、邓州等市县采集20头病死牛心、肝、脾、肺、肾、肠内容物等病料。

经细菌分离和培养，见到两端钝圆、粗大的革兰氏阳性菌。

根据细菌的形态、培养特征、生化特性、泡沫肝试验、肠毒素毒性试验及肠毒素中和试验证实其为产气荚膜梭菌。

1.主要材料
1.1病料
被检病料来自唐河、邓县、社旗等县市区的病死牛的心、肝、脾、肺、肾及病变的肠断。

采后置于消毒过的50ml或100ml广口瓶中，保持4～6℃送检。

如不能及时检验，将病料置于-18℃～-20℃冰箱中保存，检验前解冻备用。

1.2 标准血清和毒素
产气荚膜梭菌标准血清和标准毒素由中国农业科学院兰州兽医研究所研制，分别为A、B、C、D共4个型。

1.3 培养基
细菌培养基、葡萄糖血液琼脂平皿、厌气肉肝汤，普通琼脂平皿、普通肉汤均由本疫病中心制作。

厌气肉肝汤加50g/L的葡萄糖改良。

1.4 试验动物
试验用小白鼠购自河南省实验动物管理中心饲养室，体重18～20g。

试验兔来自本中心试验动物饲养场。

2.方法
2.1 细菌分离培养
2.1.1 病料接种将各种病料接种在葡萄糖血液琼脂平皿、厌气肉肝汤中。

葡萄糖血液琼脂平皿采用划线接种法，厌气肉肝汤采用组织小块接种法。

葡萄糖血液琼脂平皿接种后，焦性没食子酸厌氧法38℃培养2～3天。

培养过程中可透过平皿玻璃观察细菌的生长及溶血情况。

2.1.2 分离培养在有细菌生长、并形成β-溶血圈的葡萄糖血液琼脂平皿的菌落中挑出细菌涂片，革兰氏染色后镜检。

镜下见粗短而两端钝圆的革兰氏阳性杆菌，且有较纯的菌落，保留做增菌、鉴定用。

如果菌落中细菌混杂，但有粗短而两端钝圆的革兰氏阳性杆菌，再用葡萄糖血液琼脂平皿划线分离。

弃去无革兰氏阳性细菌生长且无β-溶血圈的平皿。

有细菌生长的厌气肉肝汤，经葡萄糖血液琼脂平皿厌氧培养，如发现其中有革兰氏阳性细菌生长，且产生β-溶血圈，则留做增菌用，否则弃去或再行分离。

2.1.3 增菌培养将分离培养的纯细菌接种在新鲜制作的厌气肉肝汤中，38℃培养72小时。

培养基变混浊、产气，显微镜下菌体粗短、两端钝圆的革兰氏阳性菌，留做鉴定用，否则弃去或再分离。

2.2 细菌的鉴定
2.2.1 菌株的选择菌株必须是革兰氏阳性菌，在葡萄糖血液琼脂平皿中厌气培养能生长且产生β-溶血圈，在厌气肉肝汤中能生长并产生气体。

2.2.2 菌落形态观察细菌在葡萄糖血液琼脂平皿上生长的菌落大小、湿润度、形状、颜色及溶血特性。

2.2.3 厌气特性取已分离纯化的菌株接种厌气肉肝汤、普通肉汤、普通琼脂平皿、葡萄糖血液琼脂平皿等培养基，38℃培养72～96h，观察细菌在各种培养基中的生长情况。

2.2.4 生化试验将分离纯化的菌株分别接种到葡萄糖、麦芽糖、果糖、含铁牛乳、硝酸盐、明胶液化、靛基质、甘露醇、甘油、水杨苷等生化培养基，38℃培养72h，观察结果。

2.2.5 兔泡沫肝试验取纯化菌株接种的厌气肉肝汤培养液，3000r/min离心20min，上清液于兔耳静脉注射，每菌株接种1只兔，每只0.3ml。

注射30min 后。

耳静脉注射空气致死，把尸体移入38℃培养箱中培养。

每30min观察一次
腹胀程度。

见腹胀、眼球突出时取出剖检，观察兔的肝、肠、胃、肾等的病变情况。

将试验兔的肝病料接种厌气肉肝汤，观察是否有细菌生长和是否产气，并用肝做组织触片镜检证实。

2.3 小动物致病试验
取纯化菌株接种厌气肉肝汤的培养液，抽去石蜡油后置于离心管中，3000r/min离心20min，取上清液注射到小白鼠尾静脉中，每只0.2ml，观察小白鼠的神经症状和死亡时间。

2.4 细菌培养物中和试验
用能对小白鼠致死的菌株接种的厌气肉肝汤培养液，3000r/min离心20min，上清液分成5份，每份0.4ml。

4份分别加0.2ml的产气荚膜梭菌A、B、C、D 型标准血清，其余1份不加血清作为对照。

在室温下作用60min，分别在小白鼠尾静脉注射0.3ml，每份注射两只。

观察20h内小白鼠的神经症状及死亡情况。

3结果
3.1 细菌分离结果
采集的20头病死牛的病料，8头分离到疑似产气梭菌，其中肠黏膜7份，肝4份，心、脾各1份，肾病料未分离出疑似菌。

3.2 细菌鉴定结果
3.2.1 菌落形态细菌在葡萄糖琼脂鲜血平皿中厌气培养48～72h见菌落凸起，呈圆形，直径3～5mm，表面光滑，边缘整齐，呈现淡灰色。

菌落周围有双层溶血圈，内圈透明，外围浅绿。

3.2.2 菌体形态用革兰氏染色，镜下见细菌单个或成双存在，形态粗短，两端钝圆，大小为0.9～1.4μm×3.0～8.0μm，革兰氏阳性，无鞭毛，无芽孢。

3.2.3 细菌培养特性细菌严格厌氧，在普通肉汤、普通平皿、血平皿中均不生长。

厌气肉肝汤中生长迅速，培养2～4h产生大量气泡，培养基均匀混浊，24h 后菌体下沉，上部变清。

用细菌给兔静脉接种后，兔肝肿胀成泡沫状，比正常肝大2～3倍，且肝组织成烂泥状，一触即破。

肠腔中也产生大量的气体，因而兔腹围显著增大。

3.2.4 细菌的生化试验生化试验结果见表1。

试验表明，产气荚膜梭菌能发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、含铁牛乳，且产气；硝酸盐还原阳性，能液化明胶，能产生硫化氢，不分解甘露醇和水杨苷；部分菌株能分解甘油。

3.2.5 细菌毒素测定及毒素中和试验琼2、琼3、琼5、琼6、琼7、琼20、琼22号菌株培养液均能致死小白鼠，致死量为0.1～0.2ml。

小白鼠注射后，有
的20～30s死亡，有的表现为精神沉郁，颤抖，0.5～9.0h后死亡。

琼2、琼3、琼5、琼6、琼7、琼20、琼22号菌株培养液均能被产气荚膜梭菌A、B、C、D 型抗毒素中和（琼4号细菌毒素未能被产气荚膜梭菌抗血清中和，被鉴定为罕见的溶血梭菌）。

3.2.6 细菌培养物的致死性细菌培养物接种小白鼠后2～10h陆续发病，小白鼠先表现为精神萎靡，抽搐倒地，直至死亡。

表1 8株菌株的生化试验结果
注：（+）为产酸产气；+为发酵试验产酸不产气，其他试验阳性；-为不分解糖类，其他试验阴性；N为未做。

4 小结及体会
4.1 从临床症状、解剖病变、细菌的分离鉴定结果判断，分离自发病牛的细菌为A型产气荚膜梭菌（琼2、琼3、琼5、琼6、琼7、琼20、琼22号，其中琼4号为较少见的溶血梭菌）。

研究结果证明，牛猝死的原因是产气荚膜梭菌引起的肠毒血症。

4.2 分离培养产气荚膜梭菌培养基除要求现做先用外，宜使用脱纤棉羊血，这样的培养基细菌生长良好、溶血圈明显。

兔血制作的血平皿对产气荚膜梭菌分离率低，应尽量避免使用。

4.3 产气荚膜梭菌是严格厌氧菌，生化试验宜用半固体培养基。

4.4 在细菌分离过程中，肠黏膜刮下物的分离率最高，达28.6%；其他病料分离率较低。

在病料采集时，以病变的小肠为主。

4.5 据有关资料记载，A型产气荚膜梭菌主要引起人或动物的气性坏疽，D 型产气荚膜梭菌可引起牛的肠毒血症。

A型产气荚膜梭菌引起牛的肠毒血症在国内罕见。