假单胞菌L-乳酸分解代谢机制及分子改造

假单胞菌L-乳酸分解代谢机制及分子改造乳酸(C3H603)作为一种常见的2-羟基羧酸,广泛地存在于自然界中和生物体内。

作为厌氧条件下糖酵解的终产物,乳酸在微生物体内参与多种生物化学过程,对某些微生物的生存、致病性及工业应用方面起到非常重要的作用,因此对微生物的乳酸代谢进行深入研究具有重要的意义。

微生物的乳酸代谢分为乳酸的合成及分解两个方向。

其中,乳酸分解代谢是微生物利用体内酶系将乳酸同化降解的过程,该过程使得某些微生物能够利用乳酸作为碳源和能源进行生长。

这一过程涉及的关键酶为NAD-非依赖型乳酸脱氢酶(NAD-independent lactate dehydrogenase,iLDH),该酶专一性催化乳酸氧化形成丙酮酸。

然而,不同的微生物中涉及的乳酸分解代谢机制及其相关基因的表达调控存在一定的差异。

本论文一方面对条件性致病菌铜绿假单胞菌PAO1(Psewudomonas aeruginosa PAO1)的L-乳酸分解代谢机制及在该菌中新鉴定的L-iLDH的调控机制进行研究;另一方面,以生物安全菌株恶臭假单胞菌KT2440(Pseudomonas putida KT2440)为对象,对利用其乳酸分解代谢系统在生物催化领域的应用展开研究。

P.aeruginosa是一种普遍存在的革兰氏阴性菌,该菌能够在多种不同的生态环境中生存繁殖,并利用环境中存在的多种化合物作为碳源和能源进行生长。

此外,作为导致人类感染的三大条件致病菌之一,P.aeruginosa能够在人体的多个部位定殖并引起宿主多种严重的急性感染或囊性纤维症(Cystic Fibrosis,CF)患者的慢性呼吸道感染。

CF患者的呼吸道中含有大量粘液,该粘液中含有包括L-乳酸、葡萄糖和多种氨基酸在内的多种营养成分,为病原微生物在
其中进行繁殖和长期感染提供了丰富的碳源和能源。

其中,L-乳酸会被P.aeruginosa优先进行利用。

已有研究报道,乳酸代谢在多种病原菌,如Neisseria gonorrhoeae,Neisseria meningitides和Staphylococcus aureus的致病机制中发挥着非常重要的作用。

然而针对CF患者痰液中的L-乳酸对P.aeruginos 致病性影响的研究却相对较少,因此,对该菌的L-乳酸分解代谢机制进行深入研究具有重要的理论意义。

本论文对P.aeruginos 的模式菌株P.aeruginosaPAO1进行全基因组信息分析,推测该菌含有两个假定的L-iLDHs(LldD和LldA),其中LldA未在其他假单胞菌的基因组中被发现。

将这两个酶在Escherichi acoli中进行外源表达与纯化,并利用人工电子受体DCPIP对纯化蛋白的基本酶学性质进行了研究,证实LldD和LldA均具有
L-iLDH活力。

对酶的底物谱进行分析,结果表明LldD具有较专一的底物特异性,仅仅对L-乳酸和L-2-羟基丁酸具有很高的催化活性;而LldA则具有更广的底物谱,对多种L-2-羟基羧酸具有明显的催化活性。

进一步测定了 LldD和LldA的表观动力学参数,确定了 LldD对L-乳酸的表观Km值和Vmax 分别为 335.78 ± 12.21 mM 和 0.19 ± 0.002 μmol min-1 mg-1;LldA 对 L-乳酸的表观Km 值和 Vmax 分别为 1102.94 ± 79.32 mM 和0.87 ± 0.045 μmol min-1 mg-1。

这一结果表明,虽然LldA对L-乳酸的最大催化速率比LldD高,但LldD对L-乳酸具有更高的亲和性。

此外,构建了 P.aeruginosa PAO1中lldD和lldA基因的单、双敲除突变株以及回补菌株,通过测定各菌株以L-乳酸为唯一碳源的生长情况及L-iLDH酶活,证实两个酶都参与到该菌的L-乳酸利用过程中。

结合超速离心和酶活测定的结
果,证实LldD和LldA均为诱导型的膜结合蛋白,其中LldD的表达可以受到两种构型的乳酸诱导,而LldA的表达则仅能受L-乳酸特异性的诱导。

通过对野生菌PAO1和lldD lldA双敲除菌株进行体外共培养实验,发现双敲除菌株在共培养过程中经过连续传代后菌量明显减少,表明L-乳酸的代谢能力
对于P.aeruginosa PAO1在CF肺部环境中的生存和竞争力发挥着非常重要的作用。

此外,相比野生型PAO1,lldDlldA双敲除菌株在模拟CF患者痰液成分的人工合成培养基(synthetic CF sputum medium,SCFM)中的生物膜形成水平明显下降,表明L-乳酸的代谢在该菌的生物膜形成过程中也发挥着重要的作用。

综合以上研究结果,结合已报道的P.aeruginosa乳酸代谢的相关特性,本论文提出了一个P.aeruginosa PAO1的L-乳酸分解代谢的模型:L-乳酸和D-乳酸经过乳酸透性酶(由lldP负责编码)转运至P.aeruginosa PAO1细胞内,其中L-乳酸在胞内由两个独立的膜结合L-iLDHs,LldD和LldA,催化氧化反应生成丙酮酸。

其中LldD的编码基因lldD同该菌中的D-iLDH编码基因dldD以及乳酸透性酶LldP编码基因lldP在基因组中位置毗邻,共同组成lldPDE操纵子,该操纵子的表达受到上游乳酸代谢阻遏蛋白LldR的调控作用。

lldD和dldD的转录表达可以同时受到L-乳酸和D-乳酸的诱导。

然而,lldA 在基因组上独立于llPDE操纵子外,其表达仅受到L-乳酸的诱导,但作用于该基因的调控因子仍未研究清楚。

LldD和LldA催化L-乳酸氧化时产生的电子进入电子传递链最终转移至分子氧,在该过程中产生的ATP为菌株生存和生长提供能量。

本论文不仅阐明了
P.aeruginosa PAO1 L-乳酸分解代谢机制,也是通过实验首次鉴定出一种假单胞菌中同时包含两种氧化L-乳酸的酶。

来源于P.aeruginosa PAO1中LldA的表达受到L-乳酸特异性的诱导,表明其编码基因lldA的转录和表达受到某种调控因子的调控。

本论文通过对
P.aeruginosaPAO1全基因组分析发现,lldA基因上游毗邻一个假定的LysR家族调控蛋白编码基因PA2383,推测lldA的转录表达可能受到调控蛋白PA2383的调控作用。

本研究在P.aeruginosa PAO1(△lldD)基础上对PA2383进行了基因敲除,考察了菌株利用L-乳酸的能力,发现该双敲除菌株不能以L-乳酸为唯一碳源进行生长。

进一步构建PA2383的单敲除菌株并对该基因进行回补表达,通过启动子分析、RT-PCR及qRT-PCR对P.aeruginosa PAO1中lldA的表达调控进行了初步的研究。

研究结果表明,当以L-乳酸为唯一碳源培养PA2383缺失菌株时,其lldA的启动子活性及转录水平相比野生菌出现了明显的下降。

这些实验结果证实
PA2383是P.aeruginosaPAO1 L-乳酸代谢的激活调控蛋白,且特异性地负责调控lldA基因的表达,这种调控作用依赖于L-乳酸的诱导。

本论文首次报道了在假单胞菌中存在一个对L-乳酸代谢起到激活调控作用的LysR家族调控蛋白。

微生物乳酸分解代谢途径可被应用于生物催化领域。

光学纯的2-羟基羧酸是一类重要的平台化合物,是多种重要药物中间体的手性前体化合物。

通过简单的化学合成或者微生物发酵方法可以获得大量的外消旋的2-羟基羧酸。

进一步以外消旋2-羟基羧酸为原料,可以经酶拆分反应生成光学纯的2-羟基羧酸。

本论文中,我们对生物安全菌株P.putida KT2440的乳酸利用系统进行比较基因组学分析,鉴定出该菌基因组中含有一个lldPDE操纵子负责乳酸的分
解代谢。

在此基础上,对该菌的乳酸分解代谢系统进行了基因工程改造,将编码
L-iLDH的lldD进行敲除,构建获得一株仅存在D-iLDH活性的菌株P.putida KTM。

利用P.putida KTM菌株的粗酶液对D-iLDH底物谱进行检测,结果显示该粗酶液只对D-乳酸和D-2-羟基丁酸具有催化活性。

利用6 g DCW L-1 P.putidaKTM全细胞为生物催化剂,在30℃,120 rpm条件下对100 mM的外消旋乳酸和2-羟基丁酸进行拆分,催化6 h成功获得光学纯度大于99%的L-乳酸和L-2-羟基丁酸,产物产率≥49.5%。

本研究利用一株仅具有D-iLDH活性的生物安全菌株制备全细胞催化剂,以外消旋2-羟基羧酸为原料,通过拆分法实现高产率和高光学纯度的L-2-羟基羧酸的生产,为光学纯L-2-羟基羧酸生产提供了一条新途径。

随着生物燃料产业的快速增长,甘油作为生物乙醇和生物柴油生产过程中的一种不可避免的副产物,其剩余量逐年剧增,这对生物燃料产业的可持续发展带来了明显的负面影响。

因此,开发新的高附加值的甘油利用途径对生物燃料经济的可持续发展具有重要意义。

丙酮酸和2-酮基丁酸是两种重要的平台化合物,其在化工、制药和食品工业中有着广泛的用途。

本研究以2-酮基羧酸生产为例,开发了一种甘油增值利用的新途径——利用甘油作为廉价碳源制备生物催化剂催化2-羟基羧酸生产2-酮基羧酸。

P.putida KT2440中的iLDHs能够分别催化乳酸和2-羟基丁酸氧化生成丙酮酸和2-酮基丁酸,催化过程不需昂贵辅因子NAD+的参与且不产生过氧化氢,具有较大的工业化应用潜力。

为了克服具有iLDHs活性的生物催化剂需要添加乳酸作
为诱导剂制备的限制,本研究通过对P.putida KT2440乳酸代谢和甘油代谢调控系统进行分析,敲除该菌中乳酸利用调控蛋白LldR的编码基因,获得可以组成型表达iLDHs的工程菌株P.putida KT2440(△lldR)。

进一步将透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin,VHb)引入该工程菌株,使工程菌的乳酸氧化活性得到了明显的提升。

最终获得的菌株P.putida KT2440(△lldR)/pBSPPccGm-vgb在利用甘油为碳源进行生长时具有组成型表达iLDHs的能力。

以廉价底物甘油作为碳源培养该菌株制备生物催化剂,分别对100 mM的外消旋乳酸和2-羟基丁酸进行催化,最终成功生产得到90.9 mM丙酮酸和99.3 mM 2-酮基丁酸,产率分别达到91.9%和99.8%。