整理)Western Blot 操作步骤

Western Blot

目录

Western Blot (1)

一、所需试剂 (2)

1、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒 (2)

2、电泳液（可回收使用2次）:配方见三 (2)

3、电转液：配方见三 (2)

4、TBST（4℃避光保存）：配方见三 (2)

5、4X Laemmli样品缓冲液（-20℃保存） (2)

6、10-180kda 蛋白marker（-20℃保存1年，4℃3个月） (2)

7、转印 (2)

8、封闭和孵育（均可用5%脱脂牛奶） (2)

9、HRP发光液： (2)

10、抗体： (2)

11、蛋白印迹膜再生液 (2)

12、其他： (2)

二、具体步骤 (2)

第一天： (2)

1、灌胶 (2)

2、配制电泳液、电转液各2L，配制TBST 1L（Tween 在需要使用时加入） (3)

3、6孔板培养处理细胞（按处理细胞所需时间提前准备），提取蛋白 (3)

第二天 (3)

1、对蛋白样品进行定量以及配制上样量（包括marker直接20μl），将一抗复温。

(3)

2、安装跑胶装置，去除梳子，上样，设置参数（根据目的蛋白大小确定）： (3)

3、电转膜： (3)

4、免疫杂交反应 (3)

第三天： (3)

5、显影（1cm2膜使用0.1mlHPR发光液） (3)

三、各种配方及注意事项 (4)

1、不同浓度的SDS-PAGE分离胶的最佳分离范围： (4)

2、不同浓度分离胶配方（其他见说明书）： (4)

3、浓缩胶(也称堆积胶、积层胶或上层胶)配方： (5)

4、电泳缓冲液配方： (5)

5、电转缓冲液配方 (5)

6、TBST配方 (5)

7、试剂使用注意事项： (5)

8、发光液的原理： (5)

9、再生液注意事项 (5)

一、所需试剂

1、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒

（1）30% Acr-Bis (29:1)（4℃避光保存）：Acr丙烯酰胺；Bis亚甲基双丙烯酰胺，两者人工聚合成聚丙烯酰胺。

（2）1M Tris-HCl, pH8.8（室温保存）：缓冲溶液，Cl-可作为前导界面，用于配制分离胶（3）10% SDS（室温保存）：十二烷基硫酸钠，是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，可以使蛋白非共价键打开，并结合在蛋白质分子上掩盖蛋白间的电荷差异

（4）Ammonium persulfate (过硫酸铵AP)（配成10%溶液分装20℃保存）：该系统的引发剂，可以释放硫酸根自由基，使丙烯酰胺单体等断裂聚合城聚丙烯酰胺

（5）四甲基乙二胺（TEMED）（4℃避光保存）：该系统的加速剂，在光照下裂解成自由基，加速聚合。一旦加入，马上开始聚合！

（6）1M Tris-HCl, pH6.8：用于配制浓缩胶，与电泳液中的甘氨酸共同构成一个电位滴度较陡的区域。

2、电泳液（可回收使用2次）:配方见三

（1）tris-base；（2）SDS(十二烷基硫酸钠）；（3）甘氨酸；（4）双蒸水

3、电转液：配方见三

（1）tris-base；（2）甲醇；（3）甘氨酸；（4）双蒸水

4、TBST（4℃避光保存）：配方见三

（1）tris-base；（2）NaCl；（3）双蒸水；（4）HCl；（5）Tween 20（避光，现配现用）

5、4X Laemmli样品缓冲液（-20℃保存）

6、10-180kda 蛋白marker（-20℃保存1年，4℃3个月）

7、转印

（1）海绵；（2）转印滤纸；（3）PVDF膜（小于20kDa的蛋白用0.2μm孔径的NC膜）8、封闭和孵育（均可用5%脱脂牛奶）

（1）封闭液；（2）一抗、二抗稀释液（也可用TBST）

9、HRP发光液：

（1）鲁米诺试剂；（2）过氧化氢溶液

10、抗体：（1）内参抗体：βactin、GAPDH、tubulin；（2）目的基因抗体

11、蛋白印迹膜再生液

12、其他：1.5mm厚玻璃板、10孔或15孔1.5mm厚梳、75%酒精

二、具体步骤

第一天：

1、灌胶

（1）按说明书配制适量浓度适量胶：分离胶8ml，浓缩胶3ml（浓度根据目的蛋白大小确定，见三）

（2）安装仪器，最后加入TEMED 后马上灌胶

（3）用75%酒精液封：轻点，此时去除气泡

（4）待胶凝固后（温度决定，20min以上），倒掉酒精，配制浓缩胶

（5）灌浓缩胶后插梳子，从一侧往另一侧以减少气泡

（6）凝固后用一次性薄膜包好放入4℃冰箱保存

2、配制电泳液、电转液各2L，配制TBST 1L（Tween 在需要使用时加入）

3、6孔板培养处理细胞（按处理细胞所需时间提前准备），提取蛋白

第二天

1、对蛋白样品进行定量以及配制上样量（包括marker直接20μl），将一抗复温。

（现在一般都在测完蛋白浓度后直接在总管里面配平加loading buffer来加热，具体见蛋白提取）

（1）浓缩胶：60-70V 30min

（2）分离胶：120V 1h

3、电转膜：

（1）活化PVDF膜（8.5cm*5.5cm）：PVDF膜用无水甲醇浸泡1-2min，活化其上的正电基团（2）准备托盘，倒入电转液，在其中准备电转物品，由下到上分别为：海绵、电转滤纸、胶、PVDF膜（在右上角标记）、电转滤纸、海绵（注意除去气泡）

（3）用刮板剥胶，在右上角标记，除去浓缩胶

（4）安装电转装置，加入冰和冰袋降温，设置参数（根据目的蛋白大小确定）：250mA，2h （5）可用考马斯亮蓝预染胶或用丽春红预染膜

4、免疫杂交反应

（1）用封闭液（或脱脂牛奶）封闭1h

（2）用一抗稀释液（或TBST或脱脂牛奶或BSA）稀释一抗（1:1000左右）4℃孵育过夜

第三天：

（3）TBST洗脱：快摇5×6min（一抗稀释液回收4℃保存）

（4）用二抗稀释液（或同上）稀释二抗（1:10000左右）：室温慢摇孵育1-2h

（5）TBST洗脱：3×10min（二抗稀释液回收4℃保存）

5、显影（1张膜大概使用1mlHPR发光混合液）

（1）两种物质等体积混合，滴加在膜上

（2）在曝光机器里显影

6、洗脱一抗二抗重新孵育

（1）加入Stripping Buffer（蛋白印迹膜再生液），8.5 cm×5.5 cm膜加入15 ml左右蛋白印迹膜再生液，室温振摇孵育15分钟左右

（2）弃去蛋白印迹膜再生液，用15 ml缓冲液（PBST或TBST）洗膜3次，每次5 分钟，室温振摇。

（3）加入15 ml的封闭液/脱脂牛奶进行封闭，室温30分钟或者4℃封闭过夜。

（4）重新加入待测一抗，进行下一轮的WB实验。