豚鼠耳蜗Hensen细胞脂滴的性质与分布

豚鼠耳蜗Hensen细胞脂滴的性质与分布
杨风波;丛涛;杨仕明;翟所强;于宁;丁大雄;吕萍;程晓婷;任红苗;黄国威;王晓东;刘晨;张悦
【摘要】目的：探索豚鼠内耳Hensen细胞（Hensen cells ，HC）中透明物质
的性质及分布。

方法10只豚鼠分离制备好耳蜗单离 Hensen细胞后，采用中性脂滴的特异分子探针Bodipy 493／503、苏丹Ⅲ、油红O染色及锇酸再固定四种染色方法对内耳组织进行染色，观察耳蜗不同区域Hensen细胞中脂滴的分布情况。

结果豚鼠耳蜗不同区域Hensen细胞内均存在高透亮物质，从顶回至底回其体积
逐渐变小，数量逐渐增加，至底回逐渐消失；该物质经Bodipy 493／503分子探针特异标记为绿色，被苏丹Ⅲ染色为橘红色，被油红 O染色为宝石红，被锇酸后
固定后呈黑色颗粒，证实为脂滴。

结论四种染色方法对内耳组织的染色结果均提示内耳 Hensen细胞中透明物质为脂类物质。

%Objective To study the distribution and properly of the transparent globules within Hensen cells (HC) of guinea -pig Corti organ .Methods The cochlear epithelial cells were isolated from 10 guinea pigs .The cells of cochlea were marked by
Bodipy493/503 ,sudan III ,oil red O ,and osmium tetroxide .Results The transpar‐ent globules within the HCs of the guinea -pigs were green staining by Bodipy493/503 ,jacinth staining by Sudan III ,ruby red by oil red O .And they were black globules stripe as post -fixed in 1% osmium tetroxide .Conclusion The results indicate that the transparent globules within guinea -pigs HCs'lipid droplets by four methods .
【期刊名称】《听力学及言语疾病杂志》
【年(卷),期】2015(000)005
【总页数】5页(P500-504)
【关键词】豚鼠;耳蜗;Hensen细胞;脂滴
【作者】杨风波;丛涛;杨仕明;翟所强;于宁;丁大雄;吕萍;程晓婷;任红苗;黄国威;王晓东;刘晨;张悦
【作者单位】川北医学院附院耳鼻咽喉科南充 637000;解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科中国人民解放军总医院耳鼻咽喉研究所;解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科中国人民解放军总医院耳鼻咽喉研究所;解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科中国人民解放军总医院耳鼻咽喉研究所;解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科中国人民解放军总医院耳鼻咽喉研究所;川北医学院附院耳鼻咽喉科南充 637000;川北医学院附院耳鼻咽喉科南充 637000;福建医科大学附属第一医院耳鼻咽喉头颈外科;中南大学湘雅二医院耳鼻咽喉科;川北医学院附院耳鼻咽喉科南充 637000;川北医学院附院耳鼻咽喉科南充 637000;川北医学院附院耳鼻咽喉科南充 637000;解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科中国人民解放军总医院耳鼻咽喉研究所
【正文语种】中文
【中图分类】R339.16
豚鼠耳蜗Hensen细胞脂滴的性质与分布
△
杨风波
1丁大雄
1#吕萍
1程晓婷
2任红苗
3黄国威
1王晓东
1刘晨
1张悦
4丛涛
4杨仕明
4翟所强
4于宁
4
【摘要】目的探索豚鼠内耳Hensen细胞(Hensen cells，HC)中透明物质的性质及分布。

方法10只豚鼠分离制备好耳蜗单离Hensen细胞后，采用中性脂滴的特异分子探针Bodipy 493/503、苏丹Ⅲ、油红O染色及锇酸再固定四种染色方法对内耳组织进行染色，观察耳蜗不同区域Hensen细胞中脂滴的分布情况。

结果豚鼠耳蜗不同区域Hensen细胞内均存在高透亮物质，从顶回至底回其体积逐渐变小，数量逐渐增加，至底回逐渐消失;该物质经Bodipy 493/503分子探针特异标记为绿色，被苏丹Ⅲ染色为橘红色，被油红O染色为宝石红，被锇酸后固定后呈黑色颗粒，证实为脂滴。

结论四种染色方法对内耳组织的染色结果均提示内耳Hensen细胞中透明物质为脂类物质。

【关键词】豚鼠;耳蜗; Hensen细胞;脂滴
DOI: 10．3969/j．issn．1006－7299．2015．05．014
网络出版时间:2015－8－28 16: 32
网络出版地址: http:
//www．cnki．net/kcms/detail/42．1391．R．20150828．1632．016．htm l
【中图分类号】R339．16
【文献标识码】A
【文章编号】1006－7299(2015)05－0500－05
* 国家973计划重大科学研究计划干细胞项目(2012CB967900与
2014CB943002)、军队项目(BWS14B080、JDZYY20132)、国家自然基金项目(81271081与81470700)、四川省卫生厅课题(110298)及北京市项目(PXM2014－178304－000002－00130227)联合资助
1川北医学院附院耳鼻咽喉科(南充637000); 2 福建医科大学附属第一医院耳
鼻咽喉头颈外科; 3中南大学湘雅二医院耳鼻咽喉科; 4解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科中国人民解放军总医院耳鼻咽喉研究所
作者简介:杨风波，男，四川人，在读硕士研究生，研究方向:听觉机制;丁大雄，男，四川人，在读硕士研究生，主要研究方向为内淋巴囊的发育。

通讯作者:于宁(Email: yuning12 @ sina．com); 吕萍(Email: lping8250@ sohu．com)
#共同第一作者
The Distribution of the Lipid Droplets within Hensen Cells in the Guinea－pig Cochlea
Yang Fengbo
*，Ding Daxiong，Lv Ping，Cheng Xiaoting，Ren Hongmiao，
Huang Guowei，Wang Xiaodong，Liu Chen，Zhang Yue，Cong Tao，Yang Shiming，Zhai Suoqiang，Yu Ning (
*Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery，Affiated Hospital of North Sichuan Medical College，Nanchong，637000，China)
【Abstract】Objective To study the distribution and properly of the transparent globules within Hensen cells (HC)of guinea－pig Corti organ．Methods The cochlear epithelial cells were isolated from 10 guinea pigs．The cells of cochlea were marked by Bodipy493/503，sudan III，oil red O，and osmium tetroxide．Results The transparent globules within the HCs of the guinea－pigs were green staining by Bodipy493/503，jacinth staining by Sudan III，ruby red by oil red O．And they were black globules stripe as post－fixed in 1% osmium tetroxide．Conclusion The results indicate that the transparent globules within guinea－pigs HCs＇lipid droplets by four methods．
【Key words】Guinea pig; Cochlea; Hensen cell; Lipid droplets
近年来，耳蜗支持细胞在听觉过程中的功能作用成为研究热点，文献报道Hensen 细胞(Hensen cells，HC)之间有缝隙连接的表达
［1］，HC胞内有大量圆形颗粒，细胞表面有大量微绒毛，且微绒毛下方胞浆中含大量的囊泡;推测HC可能向内淋巴液中释放物质并参与声音的机械能的转换。

既往研究表明Hensen细胞内有高透亮圆形小滴，形似“珍珠”，推测这些有高折光性的物质为脂滴
［2］。

随后很多学者开始将此类物质作为Hensen细胞的特征性细胞器。

1980年Miguel通过透射电镜、扫描电镜、红油O、苏丹Ⅲ等染色方法观察
了豚鼠耳蜗Hensen细胞并将“透亮水滴”定义为脂滴类物质，但其观察手段有
较大局限性，缺乏充足的定性证据。

近年来，随着分子探针技术及荧光标记技术的发展，Bodipy493/503标记物被广泛用于中性脂滴鉴定
［3］。

因此，本实验采用特异标记中性脂滴的分子探针
Bodipy493/503对Hensen细胞的脂滴类物质的性质进行探索，为下一步研究Hensen细胞功能奠定基础。

1 材料与方法
1．1试验动物豚鼠10只，皮毛纯白色，双侧耳廓无充血，耳声反射灵敏;双侧
电耳镜检查，外耳道清洁，鼓膜正常。

雌雄不限，体重300±25 g，年龄13 ±1周。

其中，用于Bodipy493/503、苏丹Ⅲ、油红O染色各3只，用于锇酸后固定1只。

动物由军事医学科学院实验动物中心(北京)提供，均通过军事医学研究伦理
委员会的批准。

1．2主要试剂
1．2．1缓冲液和固定液均按文献方法
［4］配制。

1．2．2 人工细胞外液(normal extracellular solution，NES)(mmol)142 NaCl，5．37 KCl，1．47 MgCl
2，10 HEPES，1 ml 2 M CaCl
22 H
2O，去离子水配至1 000 ml，1 M NaOH调至pH = 7．2，NaCl调
渗透压至300 mOsm
［5］。

1．2．3染液
1．2．3．1 细胞核染料NucBlue live cell stain(Life Technologies)，每1
ml NES加2滴NucBlue。

1．2．3．2脂肪染料2%锇酸、Bodipy493/503、苏丹Ⅲ染液和油红O染液。

1．3实验方法
1．3．1豚鼠耳蜗单离Hensen细胞分离制备豚鼠麻醉后断头，取颞骨，置于NES中，于解剖显微镜下，逐步去除蜗壳，螺旋韧带和血管纹，如图1a，外侧壁会从基底膜于黄色虚线处断开。

用1 ml注射器在蓝色箭头指示位置，用针尖斜面沿切线方向剔下Corti器，10 μl 0．25%胰酶消化5 min，100 μl NES稀释终止消化，吹打15次;转移至带10 mm小孔的35 mm培养皿，静置30 mim，备用。

图1 耳蜗Corti器及Hensen细胞a、耳蜗Corti器。

H: Hensen细胞; IHC:内毛细胞; OHC:外毛细胞; RM:前庭膜; TM:盖膜;黄色虚线示去除螺旋韧带及血管纹
后基底膜断裂处;蓝色箭头示针尖方向及位置(×400); b、光镜下单个豚鼠Hensen
细胞。

Dapi标记细胞核呈蓝色，→示高折光透亮颗粒;标尺为5 μm
1．3．2荧光染色微量蠕动泵灌洗制备完成的细胞3 min; Bodipy493/503(1: 200)浸染30 min;灌洗3 min; DAPI染核15 min;灌洗3 min。

即时观察活细胞无需固定，如需要等待以后观察可用4%多聚甲醛固定15 min，NES微量蠕动泵灌
洗1 min。

1．3．3苏丹Ⅲ染色微量蠕动泵灌洗制备完成的细胞3 min;加入Mayer苏木素染色液200 μl，染核5 min;灌洗3 min，苏丹Ⅲ分化液分化5秒，灌洗3 min; 70%酒精灌洗5秒，加入苏丹Ⅲ染色液100 μl ×2次，浸染1 h; 70%酒精分化5秒; NES微量蠕动泵灌洗30 min;加入甘油200 μl封片。

1．3．4油红O染色微量蠕动泵灌洗制备完成的细胞3 min;加入过滤后油红O 染液(5%油红O染液与蒸馏水按3: 2稀释，普通滤纸过滤)200 μl染色15 min; NES微量蠕动泵灌洗3 min; 70%乙醇分化10秒; NES微量蠕动泵灌洗15 min;加入甘油200 μl封片。

1．3．5锇酸后固定实验动物麻醉后，心脏灌流固定;断头取耳蜗，浸泡于4%多聚甲醛24 h，10%EDTA脱钙3天，2%锇酸与0．24 M PBS 1:1配制成1%的锇酸浸泡耳蜗2 h，0．1% PBS换洗5次;于解剖显微镜下，去除蜗壳和螺旋韧带及
血管纹。

2 结果
2．1 荧光分子探针Bodipy493/503标记结果Hensen细胞运用荧光分子探针Bodipy493/503标记后可见明显激发绿色荧光的脂滴。

Hensen细胞在光镜下的
透亮区域(图1b)与Bodipy493/503标记的绿色荧光区域高度一致(图2);可推断光镜下的透亮区域是中性脂滴。

相同条件下运用Dapi及Bodipy双标内耳细胞如:内毛细胞、外毛细胞、Hensen细胞及其他支持细胞，仅Hensen细胞被双标(图3)。

豚鼠耳蜗中不同区域Hensen细胞中的脂滴形态及数量并不完全相同。

总体而言
耳蜗顶回Hensen细胞中脂滴体积大、数量少;由顶回至底回脂滴体积逐渐减小，
脂滴数量逐渐增加(图4、图5a)，底回脂滴逐渐消失不可见。

2．2苏丹Ⅲ和油红O染色结果豚鼠Hensen细胞经苏丹Ⅲ染色后可以清晰的观察到胞质中存在橘红色脂滴，豚鼠Hensen细胞条带上可见橘红色染色颗粒条带
分布于Hensen细胞区域(图5b)。

油红O染色呈宝石红(图6a)。

2．3 1%锇酸后固定结果豚鼠耳蜗经锇酸后固定后于体视镜下观察，见耳蜗顶回有大量黑色颗粒分布于外毛细胞外侧——Hensen细胞区域，底回未观察到黑色颗粒(图6b); Hensen细胞区域的黑色颗粒由顶回到底回逐渐减小，数量先增多后减少。

图2 豚鼠耳蜗Hensen细胞中高折光性颗粒被Bodipy标记Dapi标记细胞核为蓝色，Bodipy标记脂滴为绿色。

标尺为25 μm
图3 豚鼠内耳细胞中仅Hensen细胞中有脂滴用Dapi和Bodipy双标豚鼠内耳细胞，包括:内毛细胞(a)，外毛细胞(b)，Hensen细胞(c)，Deiter细胞(d、e)及图f中红色箭头示外沟细胞，黄色箭头示外毛细胞，三角形示Hensen细胞，仅Hensen细胞被蓝色和绿色双重标记，其余细胞均未被Bodipy特异性标记。

标尺为25 μm
3 讨论
本实验从以下三方面进一步论证了Hensen细胞中的透明物质为脂
滴:①Bodipy493/503是脂肪酸的特异性分子探针，Hensen细胞中的透明物质被Bodipy493/503标记为绿色颗粒;②苏丹Ⅲ和油红O都具有亲脂性，通过相似相容的原理，被脂肪组织萃取，显色。

Hensen细胞中的透明物质被苏丹Ⅲ染色成橘红色颗粒，被油红O染色成宝石红颗粒;③锇酸与脂肪螯合生成脂肪酸锇，脂肪酸锇在光镜下不透光，呈黑色。

Hensen细胞中的透明物质被锇酸再固定后呈黑色颗
粒。

1980年Miguel A
［2］描述了豚鼠耳蜗顶回、第三回及底回的Hensen细胞中脂滴的分布情况，但未阐述豚鼠耳蜗第二回的Hensen细胞中脂滴的分布情况;本实验观察到了豚鼠耳蜗第二回Hensen细胞中仍有小的脂滴分布，相同条件下毛细胞及Deater细胞未观察到脂滴分布;推测豚鼠耳蜗底回Hensen细胞中未观察到脂滴的原因有二种可能:①脂滴大小小于显微镜的分辨率;②豚鼠耳蜗底回Hensen细胞中不含脂滴。

有研究
［6］指出耳蜗管内淋巴中葡萄糖仅为0．6 mmol/L，鼓阶外淋巴葡萄糖3．6 mmol/L，前庭阶外淋巴葡萄糖3．8 mmol/L;而脑脊液葡萄糖4．81 mmol/L。

毛细胞的高频运动会消耗大量的能量，而内耳环境却不能及时提供足够的能量。

骨骼肌和心肌也有类似情况，已有研究表明骨骼肌和心肌都能运用脂肪供能
［7，8］，正常成人心肌脂肪酸氧化供能高达60% 以上
［9，10］。

王艳
［11］报道内耳外淋巴含游离胆固醇1．57 mg/dl，总胆固醇28 mg/dl，远高于脑脊液中的胆固醇含量0．059 mg/dl。

故本实验推测外毛细胞可能可以利用脂类物质供能，但脂类物质在听觉过程中的具体作用机制还有待进一步研究。

图4 耳蜗不同部位的Hensen细胞中的脂滴形态及数量不完全相同Dapi标记
细胞核为蓝色，Bodipy标记脂滴为绿色。

标尺为25 μm
图5 豚鼠耳蜗Corti器及Hensen细胞条带a、Dapi及Bodipy标记豚鼠耳蜗Corti器条带。

大图为整体观察一段Corti器中脂滴的染色及分布，标尺为25 μm;小图为局部观察脂滴染色及分布，Dapi标记细胞核为蓝色，Bodipy标记脂滴为绿色，标尺为10 μm。

b、苏丹Ⅲ染色豚鼠耳蜗Hensen细胞条带，豚鼠耳蜗Hensen细胞条带被苏丹Ⅲ染色为橘红色，细胞核被苏木素染色为蓝色。

标尺为25 μm小图为局部放大示意图，标尺为10 μm。

图6 a豚鼠Hensen细胞中脂滴被油红O染色呈宝石红标尺为25 μm
图6 b豚鼠耳蜗锇酸再固定后Corti器边缘可见黑色颗粒豚鼠耳蜗从蜗底到蜗顶逐回聚焦Corti器Hensen细胞区，第1回未见明显的黑色脂滴，第2回开始出现稀疏的黑色脂滴，第3、4回出现大量黑色脂滴(×40)
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(2015－05－14收稿)
(本文编辑李翠娥)
·实验研究·。