siPGK1在调控黑色素瘤细胞对Vemurafenib敏感性中的作用及其机制

siPGK1在调控黑色素瘤细胞对Vemurafenib敏感性中的作
用及其机制
刘蓉;宛欣;王茜;李凡璐;景佳妮;崔香丽
【摘要】目的:研究磷酸甘油酸酯激酶1(PGK1)对BRAFv600E突变型恶性黑色素
瘤(MM)对Vemurafenib (Zelboraf)敏感性的影响及其机制.方法:采用分子生物学、细胞生物学、药理学相关实验方法(MTT、Western blot、FCM、Colongenic)探讨:①PGK1以及Vemurafenib对MM细胞的存活增殖能力的影响;②通过siPGK1基因增加Vemurafenib药敏感性的机制.结果:①沉默PGK1基因后再给以
BRAFv600E选择性抑制剂Vemurfenib,MM细胞系的存活率明显下降,并呈一定
的剂量依赖性;②siPGK1增加MM细胞对Vemurafenib的药物敏感性与激活凋亡信号通路有关.结论:siPGK1通过激活凋亡信号通路增加MM细胞对Vemurafenib 的药物敏感性,从而抑制细胞的存活和增殖能力.%Objective:To explore whether targeting phosphoglycerate kinase 1 (PGK1) can enhance the sensitivity of BRAFV600E mutation melanoma cells to vemurafenib.Methods:The methods of cell biology,molecular biology and pharmacology (MTT assay,Western blot,FCM,Colongenic assay) were used in this
study.Results:① Silencing of PGKI expression increased the efficacy of vemurafenib in melanoma cells,as evidenced by greater killing in the
tumor cells subjected to combined treatment of vemurafenib with
siPGK1;②The mechan ism of enhanced sensitivity of melanoma cells to vemurafenib was associated with activation of apoptotic signaling pathway.Conclusion:Targeting of PGK1 may represent a novel strategy of sensitizing melanoma cells to vemurafinib.
【期刊名称】《中国应用生理学杂志》
【年(卷),期】2017(033)004
【总页数】5页(P289-293)
【关键词】黑色素瘤;siPGK1;Vemurafenib;细胞凋亡
【作者】刘蓉;宛欣;王茜;李凡璐;景佳妮;崔香丽
【作者单位】山西医科大学生理学系,省部共建细胞生理学实验室,太原030001;山
西医科大学生理学系,省部共建细胞生理学实验室,太原030001;山西医科大学生理
学系,省部共建细胞生理学实验室,太原030001;山西医科大学生理学系,省部共建细胞生理学实验室,太原030001;山西医科大学生理学系,省部共建细胞生理学实验室,太原030001;山西医科大学生理学系,省部共建细胞生理学实验室,太原030001【正文语种】中文
【中图分类】R739.5;R-331
黑色素瘤(melanoma metastasis，MM)是一种常见的并且发病率持续增长的恶性肿瘤。

晚期MM患者大约25%有1年的存活率，平均存活率只有6.2个月[1]。

全球每年大概有132，000例新增MM患者[2]，中国每年大概有20，000例新
增MM患者。

据统计，2016年恶性MM的新患病人数为76,380例，死亡
10,130例[3]，成为北美第六大常见肿瘤。

引起MM的原因有很多：阳光曝晒、
室内增黑、宿主个体差异、长期接触含氯化学试剂，六价金属铬、职业等。

其中阳光照射是MM发生的最主要原因[4, 5]。

病人的预后根据地域的不同而不同，随着早期诊断和治疗可以减少死亡率。

目前针对MM的治疗药物已经有很多上市药，如：BRAF抑制剂(vemurafenib，dabrafenib)、MAPK/MEK抑制剂(trametinib，
cobimetinib)等，显著有效地提高晚期MM患者转移性疾病的预后[6]。

皮肤型MM按基因型可分为四类：BRAF突变、NRAS突变、NF-1缺失和三类野生型[7]。

大约50%的MM的BRAF基因发生点突变。

BRAF突变成V600E，激活
MAPK(RAS-RAF-MEK-ERK)信号通路，从而促进肿瘤细胞的持续生长。

这个突破性的发现导致vemurafenib的临床发展[1, 8]。

Vemurafenib是一种选择性BRAF抑制剂，于2011年八月经FDA批准上市，用于不能手术切除的MM及代谢性MM的临床治疗[9]。

早期作用效果显著，但是随着治疗时间的的持续会出现一定的耐药性，尤其是在治疗6～8个月之后，这可能与其耐药机制有关[7]。

最常见的副作用包括皮肤反应、光敏性、头痛和关节痛等。

因此，寻找新的治疗途径及靶点就显得尤为重要。

大多数肿瘤细胞，即使是在有充足的氧存在的情况下，仍利用糖酵解途径供能，即Warburg效应。

丙酮酸激酶(pyruvate kinase, PK)和磷酸甘油酸激酶
1(phosphoglycerate kinase 1,PGK1)是糖酵解通路中仅有的两种ATP生成酶。

PK是一种促进磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和ADP转化为丙酮酸和ATP的速率限制性糖酵解酶原。

PGK1是糖酵解通路中产生ATP的第一个酶原，分别促进1,3-双磷
酸甘油酸(1,3-bisphos- phoglycerate, 1,3-BPG)和ADP可逆性转化为3-磷酸甘
油(3-phosphoglycerate, 3-PG)和ATP[10, 11]。

PGK1 在人类乳腺癌、胰腺导管腺癌、抗放射性的星形胶质瘤、多重耐药性的卵巢癌细胞以及转移性的胃癌、结肠癌、肝癌细胞中表达均上调[12-15]。

但是PGK1对MM细胞的影响及其促进肿瘤的形成的机制仍不是很清楚。

本课题就PGK1基因和BRAF突变抑制剂Vemurafenib的相互作用展开研究，探讨沉默PGK1基因后，MM细胞对Vemurafenib敏感性的影响及其机制，为
MM的治疗提供新的思路。

1.1 材料
人MM细胞株： A375m、A375mR、C8161-C9、1205LU、UACC903 购自美
国 ATCC 公司；DMEM 培养基(Lot 28316013)购自美国cellgro公司；胎牛血清(FBS)购自美国biologicals公司；0.25% Trypsin-EDTA(1X)(Lot:1572281)、Pen Strep(Lot：1835957)、Opti-MEM 培养基(Lot:1491090)购自美国Gibco公司；LipofectamineTMRNAiMAX Reagent (Lot:1836078)购自美国Invitrogen公司；Control siRNA-A (sc-37007,Lot: K0816)、PGK1 siRNA(h) (sc-36215,Lot:
H2504)购自美国Santa Cruze公司；Vemurafenib，Gene Operation；Pierce 660 nm Protein Assay Reagent 购自美国Thermo公司；MTT(ThiazolylBlue Tetrazolium Bromide, approx.98% TLC) 购自美国Sigma公司；METHYLENE BLUE 购自美国Sigma公司；PGK1(Y-12)抗体(sc-17943，Lot:G1513)购自美国Santa Cruze公司；PARP Rabbit抗体(Lot:9542)、beta-Actin(D6A8,Lot:8457S)购自美国Cell Signaling公司；Polyclonal Goat Anti-Rabbit、Anti-Goat Immunoglobulins/HRP 购自美国Dako公司； Mammalian Protein Extraction Reagent(Lot:121217JE)购自美国Genlantis公司；Protease Inhibitor Cocktail Tablets购自美国Roche公司；2-MERCAPTOETHANOL(Lot:MR29303)购自美
国MP Biomedicals公司；Western blot相关试剂购自美国Bio-Rad公司。

1.2 MTT检测细胞活力
按5000个/孔的密度将MM细胞株接种到96孔板中，并于含5% CO2的37℃
细胞孵育箱中过夜，给以不同浓度的Vemuragenib处理72 h。

然后每孔加入2 mg/ml MTT 50 μl,继续在细胞培养箱中孵育2 h，之后弃去培养基，每孔再加入100 μl DMSO,于摇床上混匀10 min 分别在570 nm 和 690 nm 处读取OD值。

对于转染siPGK1及Control siRNA的MM细胞株则给以不同浓度的Vemurafenib处理48 h，其余相同。

1.3 siRNA转染
转染前一天将细胞分为siNT和siPGK1两组，并保证转染当天细胞浓度达到60%～80%；转染当天分别将siN T(20 μmol/L，5 μl)、siPGK(10 μmol/L，10
μl)、RNAiMAX(10 μmol/L，10 μl)与Opti-MEM 培养基(250 μl)混匀，室温静
置5 min；将siNT、siPGK分别与RNAiMAX混合并室温静置反应20 min；更
换培养皿DMEM全培养基为不含抗生素但含10%胎牛血清的DMEM培养基；将混合试剂分别加入到培养皿中，转染5～6 h 后更换含抗生素的培养基，并于含5% CO2的37℃细胞培养箱中培养72 h。

1.4 克隆集落形成实验
将400个MM细胞接种于35 mm的细胞培养皿中，并于含5% CO2的37℃细
胞培养箱中培养24 h，然后给用不同浓度的Vemurafenib处理，培养14 d,弃去
培养基并用1%的Methylene blue 1 ml/plate 染色30 min，用流动的自来水冲
洗干净后晾干并统计。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡
100 μl 20000-100000 MM细胞株细胞悬液，加入100 μl含Annexin V 和 7-aminoactinomycin D (7ADD)的Guava Nexin试剂，避光反应20 min，用Guava Easy-CyteTM Plus Flow Cytometry System (Millipore )流式分析仪检测细胞凋亡。

1.6 Western blot 检测蛋白表达
MM细胞弃去培养基后用冷的PBS冲洗2次，加入含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，并于冰上裂解10 min；收集裂解液并15 000 r/min，4℃离心20 min；收
集上清液，测蛋白浓度；计算上样蛋白质量为10 μg所需样品体积，加入4×上样缓冲液，98℃煮沸10 min；上样，电泳，转膜；5%脱脂奶粉封闭1 h；一抗4℃摇床孵育过夜；二抗室温摇床孵育1 h；ECL显影，暗室曝光。

检测PGK1、PARP、β-actin的表达量变化。

1.7 统计学处理
实验结果以均数±标准差表示，用SPSS 17.0 统计软件进行数据分析，每项试验重复3次及以上，用Excel和GraphPad Prism7制图，student 双样本t检验对两组数据进行比较。

2.1 BRAF突变型MM细胞株PGK1表达
首先采用Western blot检测5个MM细胞株A375m、A375mR、C8161-C9、1205LU、UACC903中PGK1的表达，结果发现4个BRAFV600E细胞株
A375m、A375mR、1205LU、UACC903的PGK1表达均高于野生型C8161-C9，其中A375m PGK1的表达量约为C8161-C9的2.26倍(P<0.01)， A375mR PGK1的表达量约为C8161-C9的1.69倍(P<0.05)，1205LU PGK1的表达量约
为C8161-C9的1.20倍，UACC903 PGK1的表达量约为C8161-C9的2.04倍(P<0.05, 图1A)。

采用沉默PGK1(siPGK1)基因从而减少MM细胞株中PGK1蛋
白的表达来检测PGK1蛋白对MM细胞株细胞存活能力的影响，和siNT组相比siPGK1明显降低PGK1的表达量(图1B)。

siPGK1后BRAFV600E细胞株的克隆
集落形成能力明显降低，且1205LU的下降最为显著，UACC903的集落形成能力下降最少(图1C)。

MTT检测PGK1基因敲除后细胞的存活能力，A375m的存活
能力下降最多(0.297±0.026)，A375mR的存活能力下降最少(0.138±0.039, 图
1D)
2.2 抑制PGK1的表达对MM细胞的Vemurafenib敏感性的影响Vemurafenib是一种选择性BRAFV600E抑制剂，明显降低A375m、1205LU、UACC903的存活能力，且对A375m的抑制作用效果最为显著。

1 μmol/L Vemurafenib即可使细胞株A375m、A375mR的存活能力分别下降至
0.35±0.01(P<0.01)、0.37±0.02(P<0.01)；但给与10 μmol/L Vemurafenib后
A375mR表现出明显的耐药性，其存活能力反而上升(0.45±0.02，P<0.01)，而
A375m的存活能力进一步下降(0.22±0.009，P<0.01)。

对野生型C8161-C9的抑制作用并没有另外4株BRAFV600E突变的细胞明显(图2B)。

接下来用MTT法检测siPGK1转染之后Vemurafenib对4株细胞存活率的影响，结果表明，siPGK1确实能够增加BRAFV600E突变的MM细胞株的药物敏感性，抑制细胞的生长和增殖。

其中以A375m、1205LU的抑制效果较为明显； A375mR在给以10 μmol/L Vemurafenib后，耐药性使细胞存活能力上升；UACC903在给以较大剂量浓度后可明显降低其存活能力(图2C)。

克隆集落实验进一步说明siPGK1和Vemurafenib有协同作用，可以抑制BRAFV600E突变的MM细胞的生长和增殖能力。

但在本实验中，随着长时间的Vemurafenib处理，A375mR的药物抵抗作用消失，10 μmol/L Vemurafenib处理14 d，集落形成率由1下降到
0.49±0.04(P<0.05)，siPGK1之后，更是从1下降到0.26±0.02(P<0.05，图2
D)。

2.3 Vemurafenib敏感性对细胞凋亡活化的影响
Annexin V和7ADD检测结果显示siPGK1和Vemurafenib联合处理
BRAFV600E突变的MM细胞株，凋亡比例随着用药浓度的增加而增加，其中
A375m的凋亡效果最为明显(图3A)。

PARP蛋白在siNT和siPGK1细胞株内表达并没有特别明显的变化，但是在给以Vemurafenib联合处理后，PARP呈明显裂解活跃状态(图3B)。

表明Vmurafenib可以促进肿瘤细胞凋亡活化水平，并且联合给以siPGK1处理后，激活效果更加明显。

进一步证明siPGK1增加BRAFV600E突变型MM细胞株对Vemurafenib的药物敏感性可能是通过激活细胞凋亡而实现的。

本课题对5株MM细胞同时进行研究，结果发现siPGK和Vemurafenib联合使用对野生型MM细胞的作用并不明显，但是对4株BRAF突变的MM作用效果也不尽相同。

A357m 对Vemurafenib敏感，在较低剂量浓度下(为其他3株MM
细胞的1/10)即可表现出较高的死亡率，siPGK和Vemurafenib联合处理，凋亡
率和存活率进一步提高。

A375mR在低剂量浓度(<5 μmol/L)发生凋亡，但在10 μmol/L时反而出现凋亡下降，存活率上升的情况，但是从克隆集落形成试验看，整体还是促进凋亡的，这可能与用药时间有关，但其机制仍有待进一步的研究。

1205LU细胞呈离散型生长，对siPGK和Vemurafenib联合处理效果明显。

UACC903也是BRAF突变型，但是其对siPGK和Vemurafenib联合治疗并没有另外3株明显，其机制有待进一步研究。

这也提示在临床治疗中要考虑个体差异，针对性治疗。

BRAF抑制剂(vemurafenib，dabrafenib)和MEK抑制剂(trametinib，cobimetinib)的联合使用已经取代单一使用BRAF抑制剂治疗MM的新的治疗方法，并成为临床治疗BRAF突变型MM的标准。

由于长期单一使用BRAF抑制剂会使病人获得性药物抵抗而失效，但是还没有研究表明联合用药是否同样会使病人发生获得性药物抵抗。

也有研究者提出使用BRAF-MEK抑制剂的同时联合使用免疫治疗，这项治疗方法仍在研究中[16-19]。

本项实验从肿瘤代谢的角度出发，将
临床治疗药物与重要代谢基因靶点结合，旨在寻找新的治疗思路。

结果显示有一定的效果，在后期实验可以考虑使用BRAF-MEK联合抑制剂与PGK1结合。

另外肿瘤细胞有其自身的代谢供能及凋亡调节机制，目前对肿瘤的治疗有化疗、放疗、免疫治疗等等[2]，同时也可以考虑从促进肿瘤细胞凋亡的角度出发，探索新的治疗
方法，如可以考虑使用一些促进肿瘤细胞凋亡的天然药物成分[20、21]。

本课题
还可以在凋亡通路方面进行更深一步的探究，对抑制PGK1的表达增加MM细胞对Vemurafenib敏感性，促进细胞凋亡从而抑制细胞生长和增殖进行更深一步的研究。

致谢：实验过程中得到美国宾州州立大学米尔顿赫尔希医学中心药学院杨金铭教授
以及任行聪教授的大力帮助。

在此表示诚挚的感谢。

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