鸡胚成纤维细胞单层培养

鸡胚成纤维细胞单层培养
一、原理
离体的器官、组织、细胞短时间并不死亡。

对机体的器官、组织、细胞提供适当的环境条件和营养物质，可使其在离体情况下继续生长和繁殖，这种技术方法分别称之为器官培养、组织培养、细胞培养，一般统称为组织培养，而在病毒学研究中通常指的是细胞培养。

原代细胞单层培养就是在无菌条件下，直接从机体取出器官和组织的全部或一部分，用机械方法或适当的组织分散剂（一般用胰蛋白酶）消化处理，使组织快分散成单个细胞悬液。

经洗涤和细胞计数，定量分装到一定的容器内，提供该细胞生长所必须的环境条件和营养物质，促使细胞贴壁并不断分裂生长繁殖，直至成均匀致密的细胞单成。

多种动物、植物、人的组织都可以用来进行细胞培养。

在实际工作中，对细胞来源的选择主要是根据细胞对病毒的易感性，细胞来源难易来决定的。

二、目的和要求
了解细胞培养的一般原理，掌握原代细胞单成培养的操作技术。

三、实验材料
1、孵育10日龄发育良好的鸡胚。

2、抗菌素溶液（每ml含青霉素10000单位、链霉素10000微克）；碳酸氢钠液。

3、洗涤液：Hank’s液（经碳酸氢钠液调节PH为7.0～7.2）；无钙、镁离子磷酸缓冲液（CMF
－PBS）。

4、细胞分散剂：0.25%胰蛋白霉溶液。

5、营养液：0.5％水解乳蛋白－Hank’s液（LH液，也称乳汉液），加入1%抗菌素溶液，5％
小牛血清，用碳酸氢钠调节PH为7.0～7.2。

6、实验器械：卵架、碘酒和酒精消毒棉球、酒精灯、镊子、血球计数板、显微镜、水浴锅、
温箱、吸球、灭菌眼科镊和剪、培养瓶、橡皮塞、吸管、平皿、三角瓶、烧杯、带有过滤纱布（四层）的漏斗。

四、操作方法
1、鸡胚的获得及处理：
（1）去10日龄发育良好的鸡胚，照蛋标出气室。

气室向上直立于卵架上，依次用碘酒和酒精棉球由中央及四周涂抹卵壳除菌消毒。

无菌操作下，用镊子去除气室部卵壳；
换无菌镊子去处壳膜，穿破绒毛尿囊膜夹住鸡胚胎颈部，取出鸡胚放于灭菌平皿中。

（2）除去鸡胚头、翅、肢体，清除内脏，用Hank’s液冲洗鸡胚三次。

（3）将清洗后的鸡胚移入无菌的小烧杯中，用眼科剪剪成1mm3的组织快，近于乳糜状。

（4）先用Hank’s液洗二次，再用无钙镁PBS洗一次，吸光上部PBS。

2、细胞的消化分散：
（1）向小烧杯组织快内加入0.25％的胰蛋白酶溶液5ml（胰蛋白酶溶液与鸡胚组织量之比为4～5：1）。

将带有组织小快的消化液移入三角瓶后加棉塞，置37°C水浴中消化20～30分钟。

每10分钟轻轻摇瓶一次，使细胞消化均匀。

（2）随时观察被消化细胞，当组织快变得疏松，表面发毛时中止消化。

吸出上部消化液，用Hank’s液轻轻加入并洗涤两次，用营养液洗一次。

（3）加入营养液少许，用吹打吸管吸入再吹出（吹打），反复数次。

静置片刻，吸上层细胞悬液经有纱布的漏斗过滤入另一三角瓶中（先吸去少量营养液蘸湿纱布，以免细
胞吸附在纱布上）。

重复加入营养液吹打，直至组织快完全分散。

3、细胞计数：
将制得的单细胞悬液轻轻摇匀，取一滴充在血球计数板上。

在低倍镜下，按白血球计
数法计算四角大方格内细胞总数。

计数时仅计算完整单个细胞，而成堆细胞只按一个细胞计算。

细胞数/ml＝4角大方格细胞总数/4×10000
4、细胞悬液的分装和培养：
按细胞计数结果将细胞悬液用营养液调节成50万个细胞/ml的细胞悬液。

将细胞悬液分装入培养瓶，分装量为瓶容量的1/10，塞紧瓶塞，写上培养日期，细胞名称、姓名。

轻轻摇动培养瓶使细胞均匀，然后静置放好，不在摇动。

放入37°温箱内培养。

一般当天不在拿动，否则会影响细胞贴壁及生长。

5、单层细胞生长情况的观察：
培养的细胞在数小时内由园拉长呈梭状，开始组织分裂，生长繁殖，大约24～36小时可长成致密细胞单层。

随着细胞的增多，大量的酸性物质产生，培养液的颜色也越变越黄。

如果营养液颜色不变化或更红，说明细胞生长不良，同时应检查细胞瓶有无破损和漏气之处。

当营养液变混浊时，表示已有细菌污染，培养失败应弃之。

细胞培养几种常用溶液的配制
一、Hank’s液
甲液：NaCL 160.0g KCL 8.0g
MgSO4.7H2O 4.0g 上述药品溶于800ml无离子水中。

CaCL2(无水) 2.8g 溶于100ml无离子水中。

上二液混合，加无离子水至1000ml，经滤纸过滤，4°C冰箱保存（若保存时间较长，可加2ml氯仿做防腐剂）。

乙液：Na2HPO4.12H2O 3.04g; KH2PO4 1.02g
葡萄糖20.00g 溶于800ml水中，加1％的酚红液32ml，加水至1000ml，滤纸过滤，4°C冰箱保存（也可加2ml氯仿防腐）。

Hank’s使用液：甲液1份＋乙液1份＋18份水，混匀。

分装小瓶，经8磅30分钟或10磅10～15分钟高压灭菌。

冷却后于4°C保存。

用前用NaHCO3溶液调节PH为7.0～7.2。

二、无钙、镁离子磷酸盐缓冲液（CMF－PBS）
NaCL 8.0g KCL 0.2g
Na2HPO4.12H2O 2.89g KH2PO40.2g 加无离子水至1000ml，搅拌完全溶解。

滤纸过滤，分装。

15磅15分钟高压灭菌，冷却后置4°C备用。

三、0.5％水解乳蛋白－Hank’s液（LH液、乳汉液）
水解乳蛋白 5.0g Hank’s液1000ml 搅拌溶解后，分装。

8磅30分钟或10磅20分钟高压灭菌。

冷却后置4°C 保存备用。

四、0.25％胰蛋白酶溶液
活性1：250胰蛋白酶0.25g CMF－PBS 100ml 置37度水浴，直至液体透明清亮。

用NaHCO3溶液调节PH至7.6。

过滤除菌，分装。

密封置－20度保存。

注：所谓1：250即指每克胰蛋白酶能消化250克酪蛋白。

五、1％的酚红溶液
酚红1克置乳钵中，加入少量1N NaOH研磨，NaOH越少越好最多不超过7ml。

溶解后用水反复冲洗乳钵数次，收集酚红溶液加水至100ml，滤纸过滤。

高压消毒，4度保存。

六、NaHCO3溶液
称取NaHCO32.8或4.4克、7.0克、7.5克、7.8克、8.8克加入水100ml，溶解后制的2.8％或4.4％、7.0％、7.5％、7.8％、8.8％NaHCO3溶液。

经15磅10分钟高压灭菌或过滤除菌，4度保存备用。

七、青、链霉素液（双抗液）
青霉素G钾100万单位硫酸链酶素100万微克无菌操作下用灭菌水100ml溶解，分装小瓶，冻存于－20度备用。

八、两性酶素B液（Amphotericin B）
两性酶素B 2.05g 灭菌无离子水100ml
充分溶解，分装小瓶，于－20度保存备用。

九、阿氏液（Alsevers）
葡萄糖 2.05g 枸橼酸钠0.8g
枸橼酸0.055g 氯化钠0.42g 加水至1000ml，微加热溶解，8磅20分钟高压灭菌，4度备用。

可按一份阿氏液1～3份血液做血液保存剂，血液一般可保存21天。

十、Pucks盐水
NaCL 8.0g KCL 0.4g
葡萄糖 1.0g 1％酚红 2.0ml 加双蒸水至1000ml，此液用10磅10分钟高压灭菌。

使用液按1.25％加入2.8％碳酸氢钠溶液。

本液用于稀释细胞分散剂和洗涤分散剂处理前的细胞培养物。