免疫荧光法检测L-NNA对脑缺血再灌流后海马区GFAP合成的影响

免疫荧光法检测!!""#对脑缺血再灌流后海马区$%#&合成的影响!
张敬军陈青!夏作理
（泰山医学院附属医院神经内科，泰安"#!$$$）
中国图书分类号%&’’"；%’""()!；%’*!；%’*!(#；
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文献标识码,文章编号!$$!&!+#)（"$$"）$!&$"!#&$’
摘要目的探讨-.&硝基&!&精氨酸（!&--,）对沙土鼠海
马区胶质纤维酸性蛋白（./,0）合成的影响。

方法钳夹沙
土鼠的双侧颈总动脉制造脑缺血模型，应用免疫荧光法染色。

结果脑缺血再灌流后海马区./,0合成增加，./,0阳性细胞主要分布在放射层及分子层，!&--,能抑制海马区./,0的合成。

结论!&--,是一氧化氮合酶强的抑制剂，!&--,可能通过抑制-1的产生抑制了./,0的合成。

关键词!&--,；脑缺血；海马；胶质纤维酸性蛋白
中枢神经系统内星形胶质细胞和神经元密切相关，星形胶质细胞参与神经元功能的调节，并在联系和维持神经元生存微环境中起重要作用。

脑缺血后星形胶质细胞活化，其机制尚未完全阐明。

本文探讨脑缺血再灌流后一氧化氮合酶（-123456728，-19）抑制剂-.&硝基&!&精氨酸（!&--,）与胶质纤维酸性蛋白（:;<7;=<>?<;;7?37@<A<@B?C58<4，./,0）合成调节的关系，为星形胶质细胞的活化机制和新药的研究提供新的思路。

"$$!D$)D"’收稿，"$$!D!!D!$修回
!山东省自然科学基金资助课题，-CE"$$$F"’
!山东泰安卫生学校，泰安"#!$$$
作者简介：张敬军，男，’)岁，副教授，硕士研究生导师，曾赴日本做访问学者!年。

G8;：$H’)&I""""+"’材料与方法
’J’实验动物"沙土鼠#$!)$:（约!"K L龄）*$只，随机分为H组，脑缺血*组，假手术对照组!组，每组)只。

’J(试剂与仪器抗./,0抗体和!&--,（9<:& M7公司）；%N G F标记的抗鼠N:.（@68M<@C4<458?47& 5<C47;N-F公司）。

温差电偶仪G O P’$$（日本Q& 4<R S8公司）；脑组织切片机（日本T9U）。

’)*孵化液的配制（++,-·./’）-7F;!"!(!，U F!!()#，U V"01*!(!#，O:91*!(!H，-7V F1’"*(+，F7F;"!("，葡萄糖!!($，B V!(*。

在冰冷的条件下向上述配好的溶液通F1
"
W1"（H X W+H X）进行饱和，"$M<4后使用。

’J0脑室用药及脑缺血模型的制作脑缺血组：立体定向，用汉密尔顿微量调节注射器分别向右侧侧脑室注射人造脑脊液H";，人造脑脊液溶解的不同浓度的!&--,H";（分别注射!("H:·Y D!、"(H:·Y D!及H($:·Y D!）。

脑室用药’$M<4后，用!HM;·Y D!三氟溴氯乙烷吸入麻醉，选择一侧脑区，在前囟前及前囟一侧各"M M的交叉点，用温差电偶探针垂直进针"M M，监测脑温并维持在（’#Z$("）[。

暴露两侧颈总动脉，停止麻醉药，用无损伤的血管夹立即夹闭双侧颈总动脉，H M<4后撤夹恢复血流。

假手术对照组)只除不夹闭双侧颈总动脉外，其它实验步骤同实验组。

模型成功标准是：阻断双侧颈总动脉血流后，动物立即出现呼吸加快，肢体痉挛，
@84@858@64<R S8J-1@C45845C=B;72M7K72722738A >32B8@5?C B6C5C M85?3J1234.53/O.<46<><58A 568B;758;857::?8:75<C474AH&V G?8;8728，<4@?8728A 568-1@C45845C=B;72M7，A8@?8728A568K6C;8>;C C A \<2@C2<53，B;72M7\<2@C2<53，8?3?C@3588;8@5?C B6C?82<2 5<M8，"\7;S8C=8?356?C@35828A<M84575<C48R S75<C4 74A%]F，<M B?C\8A56868M7?68C;C:3C=?752J67"!
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中国药理学通报45*6$’$75&18&90,0+*9&,:),,$%*6"$$"/8>；’9（"）："!#!+
在!"#!!$%&内昏迷。

血流复通后，动物分别在’!!"$%&内苏醒，不合上述标准者弃去不用。

!("海马脑片的制备及染色恢复血流!’$%&后
将动物断头，迅速取脑，剥离海马并固定于切片机上，切成)"""$的脑片。

剥离海马、切片、取片均在通*+
,
-+,（’-.’）的冰冷孵化液中操作。

将样本
的脑片分别置于孵化液中，在*+
,
-+,（’-.’）)/0的孵化箱中孵化1"$%&；加多聚甲醛（最终浓度1"2·34!）孵化!"$%&；1"2·34!的多聚甲醛固定,5；用含’"2·34!蔗糖的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（678）洗)"$%&；恒冷切片至!""$。

用!""$9·34!羊血清孵化)"$%&（)/0），用抗:;<=抗体（!-,""）孵化!>5（10）。

678冲洗，用?@6*标记的抗鼠@2:（!-,""）孵化."$%&（)/0），冲洗、封片、荧光显微镜观片。

用678代替一抗做空白对照。

#结果
根据:;<=染色强度可分为强阳性、中等、弱阳性)种类型。

:;<=强阳性表现为:;<=阳性星形胶质细胞胞体肥大，突起增多、增粗、变长以及细胞数目明显增多；:;<=弱阳性表现为:;<=阳性星形胶质细胞胞体瘦小且细胞数目很少，突起细短；中等强度介于两者之间。

实验显示:;<=阳性反应细胞主要分布于海马本部始层、放射层及分子层。

脑缺血组实验结果表明，#脑脊液组：星形胶质细胞胞体明显肥大，数量明显增加，突起明显增多、增粗、变长，:;<=反应呈强阳性。

$!A B B<（!C,’2·34!）组：部分星形胶质细胞呈强阳性，部分呈中等阳性。

%!A B B<（,C’2·34!）组：多数星形胶质细胞呈中等阳性。

&!A B B<（’2·34!）组：星形胶质细胞胞体瘦小，且数量减少，多数:;<=反应呈弱阳性。

假手术对照组:;<=反应微弱，呈弱阳性。

每例动物取>张连续的冠状背侧海马切片，在荧光
显微镜下进行单侧计数海马本部*<
!
区!$$长度范围内的:;<=阳性细胞数，其定量分析结果见6D E!。

每组鼠结果一致。

空白对照实验结果为阴性。

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!A B B<（’("2·34!）.!L1()"">讨论
短暂性前脑缺血再灌流后，:;<=染色在始层、放射层及分子层反应呈强阳性，表明星形胶质细胞被活化。

在脑缺血再灌流过程中，星形胶质细胞对缺血性神经元的作用是复杂的。

一方面活化的星形胶质细胞提高了修补血脑屏障及维持水电酸碱平衡的能力［!］，提高了灭活兴奋毒谷氨酸的能力，提高了释放神经生长因子支持神经细胞存活和轴突生长的能力［,，)］。

另一方面，活化的星形胶质细胞分泌大量的B+，内皮素A!和内皮素A)等，对缺血性神经元有毒性作用［1］。

星形胶质细胞的活化机制尚未完全阐明，可能与下列因素有关：脑缺血时，兴奋性递质谷氨酸从突触前膜释放作用于突触后膜上的谷氨酸受体，突触后膜去极化达一定程度，降低了镁离子对谷氨酸受体的阻断，促使钙离子内流，当钙离子在细胞内积聚达一定水平时，使激活了&B+8，引起B+合成增加。

此外脑缺血后，小胶质细胞数分钟被活化，活化的小胶质细胞分泌白介素!’（%&N M H A 9M J P%&A!’，@3A!’），后者刺激星形胶质细胞也产生B+［’］。

B+作为一种不典型的神经递质，其作用特点是不储存在突触小泡中，也不是以量子方式释放，而是以扩散的方式到达靶细胞，其受体不在细胞膜上，而位于胞质中的鸟苷酸环化酶（2J D&Q9Q9R Q R9D#M，:*）活性位点上的铁离子，激活可溶性:*使R:S=合成增加，R:S=的效能是否与:;<=的合成有关尚待进一步研究。

文献报道，脑室注射放免标记的!A B B<能到达两侧侧脑室及海马区［>］。

本研究中，我们用小剂量脑室注射!A B B<使药物更有效地到达海马区和避免许多潜在的问题，如：药物是否透过血脑屏障，脑血流减低等。

实验结果表明!A B B<能抑制:;<=的合成，并且剂量与抑制:;<=的合成呈正相关。

其机制可能是!A B B<抑制了脑缺血诱发的B+8活性，也就抑制了B+的产生及其介导的信号传导。

活化的星形胶质细胞发挥“双刃”效应，进一步研究星形胶质细胞的活化机制，探讨新的治疗策略，既发挥星形胶质细胞的保护作用，又抑制星形胶质细胞的毒副作用，具有重要的意义。

参考文献
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·中国药理学通报23."’$’%3)-4)51*16.5)*,7**’(.","",<K H；!A（,）
总丹酚酸对脑缺血再灌注损伤的保护作用!
任德成杜冠华张均田
（中国医学科学院·中国协和医科大学药物研究所，北京!"""#"）
中国图书分类号$%&&’；$’()*!；$&’’*(!；$&)"*#；
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文献标识码.文章编号!""!%!+-(（’""’）"’%"’!+%"&
摘要目的研究总丹酚酸对脑缺血再灌注损伤的保护作用。

方法采用跳台法和断头法，观察总丹酚酸对缺血再灌注小鼠学习记忆功能障碍的作用和耐缺氧能力的影响。

采用化学法，观察总丹酚酸对缺血再灌注小鼠脑组织中超氧化物歧化酶的（/01）活性，丙二醛（21.）和谷胱甘肽过氧化物酶（3/4）的含量。

结果总丹酚酸改善缺血再灌注引起的学习记忆障碍，缩短被动回避反应时间，减少错误次数，延长潜伏期，延长断头后呼吸持续时间。

总丹酚酸亦增强缺血再灌注小鼠脑组织/01的活性，降低21.含量，增加3/4的含量。

结论总丹酚酸对脑缺血再灌注损伤有明显的保护作用，其机制与总丹酚酸抗氧化作用有关。

关键词总丹酚酸；缺血再灌注；抗氧化
’""!5"+5"#收稿，’""!5!’5!’修回
!国家科委!"&#项目及新药基金资助课题，678+#%!’%’-
作者简介：任德成，男，&"岁，博士生；
杜冠华，男，),岁，教授，国家药物筛选中心主任。

9:;：
"!"%,&!,#&!&，,&!,#!()，<%=>?;：@A B C!?==D>E D E F
缺血再灌注损伤与多种疾病的发生、发展有关，其作用机制与氧自由基产生增加、兴奋性氨基酸释放增加、钙超载等密切相关。

总丹酚酸是一类有多个酚羟基的化合物，系丹参水溶性成分。

以往的研究发现其有抗脑缺血、抗血栓作用［!，’］，本研究观察了总丹酚酸对脑缺血再灌注小鼠学习记忆功能障碍的改善作用，并对其机制进行初步探讨。

!材料
!"!试剂总丹酚酸（批号：+(!""(）由本所植化室提供，含丹酚酸.、G、迷迭香酸、原儿茶醛等酚酸类化合物，其中以高压液相分析法测得丹酚酸G的含量为)"H；硫代巴比妥酸（9G.），上海试剂二厂产品；其余试剂均为市售分析纯产品。

!"#仪器跳台实验自动记录仪，中国医学科学院药物所仪电室产品；荧光分光光度计，日本4I% 9.J4I公司产品；酶标仪，美国27;:E A;>K产品。

!"$动物昆明种小鼠，"，’""’#B，中国医学科学院试验动物中心提供，合格证：医动字"!%&""(。

#方法
&9>L:@>.，0F7@:K>4，/A B?=7M7.!"#$%I F@A E M?7F7N C:O>K?F% P?F@?F B B K7Q M C%>R R7E?>M:@=7;:E A;::S O K:R R?7F?F K:>E M?T:>R M K7E U M:R N7;;7Q?F B C?O O7E>=O>;F:A K7F>;?F V A K U D&!’()*+,!-+!，!++#；%&（!）：#-",)
)张敬军，夏作理，陈青D脑缺血再灌流后海马区胶质纤维酸性蛋白的动态表达及意义D神经解剖学杂志，’"""；!%（)）：&,-"-"#/>?K>F:F9$，W?F@R P:K B X Y，G K:F F:K2!"#$%3;7P>;N7K:P K>?F?R%
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