5-芽孢杆菌检测试验方法

芽孢杆菌检测试验方法
所用的分析天平，移液管，滴定管，容量瓶等玻璃器皿按有关检定规定定期校正。

所用的水，在未注明其他要求量，均指蒸馏水或去离子水，所用的试剂，在未注明规格时，均为分析纯(A.R)
4.1 感官指标：
4.1.1 感官特性：从抽取的样品中，取适量倒在白纸或玻璃板上，在光线充足的条件下，观察颜色和状态，并品尝滋味，闻其气味。

4.1.2 过筛率：随机抽取500 g样品，取40目和20目的筛子，将样品取出100g 称重，过筛，再次称重，计算过筛率。

过筛后的总质量
过筛率=-----------------×100%
过筛前的总质量
4.2菌种鉴别
4.2.1菌落形态：培养24小时，暗白色或浅黄色圆形菌落，中央有小突起，不透明，表面干燥，菌落易挑起。

4.2.2 镜检菌体形态：0.5-0.6*2.5-3.5微米，杆状，中生芽孢、即使孢囊膨大、也不显著。

4.2.3 革兰氏染色：革兰氏阳性菌。

4.3 芽孢杆菌活菌总数
4.3.1仪器、设备、试剂和培养基
a.分析天平，感量为0.01g；
b.恒温水浴锅；
c.震荡器；
d.高分辨力相差显微镜；
e.湿热灭菌锅；
f.超净工作台；
g.研钵；
h.血球计数板，XB-K-25；
i.血球计数板专用盖玻片，20mm×20mm；
j.加样枪；
k.各类玻璃器皿。

9ml0.85%的无菌生理盐水试管，
80ml 0.85%的无菌生理盐水的三角瓶，
30ml 0.85%的无菌生理盐水的三角瓶，
空的500ml三角瓶（内装10～15颗玻璃珠），
空的20ml的刻度试管，
1ml吸管，
培养基配方：营养琼脂粉38g，蒸馏水1000ml。

上述物品，121℃，30分钟蒸汽灭菌后备用。

在超净工作台上将灭好菌的营养琼脂倒平皿，每个大约20ml，放在紫外灯下吹风1小时，然后放在工作台面过夜，第二天备用。

4.3.2 预处理：准确称取样品 1.00克，将其全部转入一只已消毒的直径约10
厘米的研钵中，从上述30ml 0.85%的无菌生理盐水三角瓶中取出约5ml水加入研钵，研磨10分钟，然后使用无菌生理盐水将其全部转移到空的20ml的刻度试管中，定溶至20ml，用振荡器震荡2分钟，将其全部震荡均匀。

4.3.3 活化及固定：由于芽孢杆菌能游动影响计数，芽孢菌在生长时聚成团，影响计数，故采用80℃的水浴10分钟的处理，将芽孢活化分散，将杆菌固定。

将振荡均匀的试管放入80℃的水浴锅中加热处理10分钟，其中5分钟时取出用振荡器振荡30秒，再次水浴5分钟后迅速冷却至37℃左右备用。

4.3.4稀释：使用80ml 0.85%的无菌生理盐水将上述制备好的试管在超净工作台上全部转入一只无菌的500ml三角瓶（内装10～15颗玻璃珠）中。

在摇床上37℃,200rpm摇动10分钟。

取出，振荡均匀后用1ml的无菌吸管准确吸取1ml 溶液，转入到装有9ml无菌生理盐水的试管中。

使用振荡器振荡2分钟。

振荡均匀后用1ml的无菌吸管准确吸取1ml溶液，转入到装有9ml无菌生理盐水的试管中。

如此稀释样品至1×10-8后备用。

每次操作必须使用无菌吸管，吸管不可重复使用。

4.3.5 涂平板及培养：准确吸取上述1×10-8样品液体0.1ml，接种在琼脂平板培养基上，再用无菌刮铲在平板上涂抹均匀。

设2个重复和一个空白对照。

将涂抹好的平板平放于桌上20-30分钟，使菌液渗透于培养基内，然后将平板保温37℃培养16-24hr至长出菌落即可计数。

4.3.6计数：典型菌落为暗白色菌落，中央有小突起，不透明，表面干燥，菌落易挑起。

较嫩的菌落或成片芽孢可能长成表面湿润的球状或泡囊状菌落。

由于枯草芽孢杆菌能够游动，在固体培养基上生长菌落各种形态都有，故有可能出现与上述典型菌落不同的菌落，可以通过显微观察确定是否为枯草芽孢杆菌。

4.4 杂菌率
4.4.1 原理：细菌在营养琼脂平板上长出的菌落个数即为样品中的细菌总数。

根据菌落形态和显微观察可以分辨出是否为枯草芽孢杆菌。

杂菌占细菌总数的比值即为产品的杂菌率。

4.4.2 试验设备与器材：
a.分析天平，感量为0.01g；
b.震荡器；
c.恒温培养箱；
d.湿热灭菌锅；
e.超净工作台；
f.各类玻璃器皿。

4.4.3 试剂与溶液：
0.85%的无菌生理盐水。

培养基配方：营养琼脂粉38g，蒸馏水1000ml。

4.4.4 操作步骤
4.4.4.1 精确称取枯草芽孢杆菌样品1g（精确至0.01g），转入内装9ml无菌生理盐水的试管中，使用振荡器振荡2分钟，使样品充分溶解备用。

4.4.4.2 吸取4.4.4.1的检液1ml，加入装有9ml无菌生理盐水的试管中，振荡摇匀。

4.4.4.3 按4.4.4.2操作，至样品溶液稀释到1×10-7备用。

每次操作必须使用
无菌吸管，吸管不可重复使用。

4.4.4.4 准确吸取上述1×10-7样品液体0.1ml，接种在琼脂平板培养基上，再用无菌刮铲在平板上涂抹均匀。

设2个重复和一个空白对照。

将涂抹好的平板平放于桌上20-30分钟，使菌液渗透于培养基内，然后将平板保温37℃培养24hr 至长出菌落即可计数。

4.4.4.5 计数时注意只数非芽孢杆菌，不要数典型的芽孢杆菌菌落。

若有的菌落无法确定，可继续培养至48小时确定，仍不能确定的，采用显微观察进行确定。

以2个重复的菌落数相差不悬殊，每皿菌落数在10-100之间来确定此操作的准确性，否则需要重新操作。

最终菌落总数取2皿中菌落总数的平均数。

以上操作均为无菌操作。

4.4.5 计算
X1=A×10×B
式中：X1-----每克样品中杂菌数(个/克)
A------最终计数的菌落总数
B------稀释倍数
X1
Y= ---------×100
X1+ X0
式中：Y ------产品中的杂菌率（%）
X1-----每克样品中杂菌数(个/克)
X0-----每克样品中的芽孢菌数(个/克)
4.5 水分按照GB/T 6435-1986执行。

4.6 砷按照GB/T 13079-1999执行。

4.7 铅按照GB/T 13080-1991执行。

4.8 沙门氏菌按照GB/T 13091-2002执行。

3检验规则
5.1 出厂检验
5.1.1 成品出厂前须经公司综合产品部逐批检验合格，并签发合格证。

5.1.2 出厂检验项目为表观指标、芽孢活菌数（研磨加热后平板法）、杂菌率、水分。

5.2型式试验
5.2.1出现下列情况之一时，应做型式试验：
a）产品正式投产时；
b）原材料、工艺有重大改变，可能影响质量指标时；
c）停产2个月以上恢复生产时；
d）出厂检验结果与上次型式试验结果有较大差异时；
e）国家质量技术监督部门提出要求时；
f）检测中心每月对枯草芽孢杆菌进行抽检2－3批次。