CHRDL1基因启动子区变异与沐川乌骨黑鸡肤色的相关性研究

CHRDL1基因启动子区变异与沐川乌骨黑鸡肤色的相关性研
究
喻世刚;毛聆;王钢;廖娟
【摘要】文章探讨了CHRDL1基因启动子区多态性与沐川乌骨黑鸡肤色性状(背部肤色、翅下肤色、冠色和胫色)的相关性.在CHRDL1基因启动子区ATG上游949 bp处发现一个SNP位点(c.-949T>C),CC基因型频率最高(0.368),TT基因型最低(0.304).相关性分析表明,CT基因型个体背部和翅下皮肤肤色L值显著高于CC 和TT基因型(P<0.05),CT基因型个体鸡冠皮肤肤色L和a值极显著高于CC和TT 基因型(P<0.01),CC和CT基因型个体胫色a值显著低于TT基因型(P<0.05).上述结果表明,SNP c.-949T>C与沐川乌骨黑鸡肤色性状具有显著相关性,该SNP位点可作为沐川乌骨黑鸡选育的分子遗传标记之一.
【期刊名称】《乐山师范学院学报》
【年(卷),期】2018(033)012
【总页数】5页(P30-34)
【关键词】CHRDL1基因;SNP;沐川乌骨黑鸡;肤色性状
【作者】喻世刚;毛聆;王钢;廖娟
【作者单位】乐山师范学院(川南地方品种鸡产业化四川省高等学校工程研究中心),四川乐山 614000;乐山师范学院(川南地方品种鸡产业化四川省高等学校工程研究中心),四川乐山 614000;乐山师范学院(川南地方品种鸡产业化四川省高等学校工
程研究中心),四川乐山 614000;乐山师范学院(川南地方品种鸡产业化四川省高等
学校工程研究中心),四川乐山 614000
【正文语种】中文
【中图分类】S831.2
0 引言
鸡脊索生成素样蛋白1（Chordin-Like 1，CHRDL1）基因位于四号染色体，编码456氨基酸，是一种骨形态发生蛋白（BMP）拮抗剂[1]。

研究发现，BMPs家族
中部分成员可参与调节毛囊的发育过程，BMP2、BMP4、BMP7在毛囊的发育中均有表达[2]。

程博涵等[3]人对鸡的BMP4基因结构与功能进行了分析，发现BMP4具有信号肽和潜在的糖基化、磷酸化位点，进一步表明该生长因子在软骨
与骨形成、原始卵泡发育、干细胞分化为脂肪细胞及早期胚胎发育中的重要作用。

吴江鸿等[4]通过定量PCR技术分析了在不同时期山羊毛囊中BMP4基因的表达，结果表明BMP4基因参与山羊毛囊发育的调控过程，是调节山羊绒周期性生长的
重要因素之一。

杨童奥[5]研究证明BMP4基因与鹅羽毛生长发育和羽毛形态变化密切相关。

目前，CHRDL1基因与家禽羽毛颜色、皮肤肤色以及其他皮肤衍生物
颜色的研究未见报道。

本课题组前期采用高通量测序技术分析了黑羽和白羽毛囊转录组，结果表明CHRDL1基因的mRNA表达与毛囊中黑色素的合成密切相关，CHRDL1基因为一个潜在的黑色素合成候选基因。

因此，本文分别建立了黑色皮
肤和白色皮肤个体的DNA混池，扫描了CHRDL1基因启动子区的遗传变异，并
分析了相关遗传变异与肤色性状的相关性。

由于启动子区的变异是基因转录水平调控基因表达的一个重要形式，阐明CHRDL1基因启动子区SNP对乌骨鸡肤色的影响，将为进一步阐明该基因在乌骨鸡皮肤黑色素合成中的作用提供理论基础。

另外，
获得的SNP可作为肤色的候选分子遗传标记，应用于乌骨鸡肤色的分子遗传标记
辅助选择育种中，能提高乌骨鸡个体选择的精度。

1 材料与方法
1.1 试验对象
本试验样本来自四川省乐山市沐川县黑凤凰乌骨鸡业有限公司，一共选取了120
只成年健康的沐川乌骨黑母鸡，所有的实验对象均处于该养殖公司统一饲养管理与卫生防疫条件下。

1.2 主要实验仪器设备与试剂
1.2.1 实验仪器
NR110型精密色差仪，由深圳市三恩驰科技有限公司生产；电泳仪（BioVoltTM 250）、梯度PCR 仪（SelectCyclerTMII）、低温高速离心机（SelectspinTM17R），均由美国 Select BioProduct公司生产；恒温水浴锅（HWS-26），由上海一恒科学仪器有限公司生产；凝胶成像系统（c300），由
美国 Azure Biosystems公司生产；电子分析天平（FA2204N），由上海菁海仪
器有限公司生产；高压灭菌锅（BXM-30R），由上海博迅实业有限公司设备厂生产。

1.2.2 实验试剂
EDTA-Na2、Tris-HCI、聚乙烯吡咯烷酮、3M乙酸钠、β-巯基乙醇、十二烷基硫酸钠，均由北京索莱宝科技有限公司生产；NaCl，由德国SIGMA-ALDRICH公司生产；异丙醇，由山东西亚化学工业有限公司生产；无水乙醇，由成都市科龙化工试剂厂生产；PCR Taq MasterMix、琼脂糖、DNA Maker、核酸染料Gelstain，均由北京全式金生物技术有限公司生产。

1.3 血样采集及肤色测定
1.3.1 血样采取
采用一次性注射器在乌骨鸡的翅下静脉进行血液采取，将采集的约0.3 mL血液存放于装有300 uL抗凝剂（EDTA）的1.5 mL离心管，编号后置于-20℃保存。

血液DNA的提取参考喻世刚[6]的方法。

1.3.2 肤色测定
采用NR110型精密色差仪对每一只乌骨鸡的背部肤色、翅下肤色、胫色和鸡冠色进行测定。

肤色测定值以L、a、b值来表示，L值表示亮度系数，数值越小，肤色越黑。

具体测定方法详见参考文献[7]。

1.4 DNA混池的构建
分别从采集的120个样本中筛选了肤色较黑的10只鸡（平均L值）和肤色较白的10只鸡（平均L值），每个个体取等量DNA分别构建两个DNA混池，即黑色皮肤DNA混池（B组）和白色皮肤DNA混池（W组）。

1.5 引物设计
参照NCBI数据库中CHRDL1启动子上游序列（NM_204171.1），采用引物设计软件Primer Premier 5软件（PREMIER Biosoft,Palo Alto,CA,USA）设计3对
引物（引物1-3）完成CHRDL1启动子区的PCR扩增。

同时通过比对分析B和
W组DNA混池的PCR产物测序结果，筛选候选SNP。

采用等位基因特异PCR （AS-PCR）的方法设计了特异扩增引物（引物4），完成候选SNP的基因型分析。

引物合成与测序均由成都擎科梓熙生物技术有限公司完成，详细信息见表1。

表1 引物序列信息引物名称引物序列引物1扩增片段大小（bp）673 bp退火温
度（℃）60℃引物2773 bp 60℃引物3682 bp引物4 F：CCTAGCAGCATGCAGAGTGA R：ACGACACAGGAATGGGCAAA F：CCCATTCAGCGTCCTTTCCT R：GCAGACACCCTCTGCTGATT F：TCATTTGTCAAGGGTTCGCTG R：TCGGCTCTTCCCTTCGCTC F1：CAGCGCTCCGCGAGCTCT F2：CAGCGCTCCGCGAGCTCC
R:GCAGACACCCTCTGCTGATTGC 290 bp 60℃62℃
1.6 个体基因型分析
采用AS-PCR扩增对样本进行基因型检测，PCR反应体系为12.5 uL Taq酶、上
游引物和下游引物各 0.5 uL、1 uL DNA、10.5 uL ddH2O。

PCR反应程序：
94 °C 预变性 5 min，94 °C 变性 30 s，62 °C退火30 s，72 °C 延伸 30 s，进行30个循环后，72°C延伸10 min，4°C保存。

PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳
并成像拍照。

1.7 统计分析
采用Excel 2013进行试验数据的汇总，运用Spss 20.0进行数据统计分析，不同
基因型之间的比较采用one-way ANOVA进行统计，P<0.05表示差异，有统计
学意义，P<0.01表示差异极显著。

所有数据均以平均数±标准差表示。

2 结果与分析
2.1 肤色测定结果
采用NR110型精密色差仪测量120只沐川乌骨黑母鸡不同部位的肤色并测量体重。

结果如表2所示，群体平均体重为2.39±0.48 kg，鸡冠色L值最小（42.99），
表明鸡冠是乌骨鸡最乌的部位。

表2 成年沐川乌骨黑鸡不同部位肤色值部位背部翅下鸡冠胫L值54.85±5.22 53.53±1.18 42.99±9.36 54.99±5.64 a值2.67±1.27 2.14±0.88 3.96±3.73
1.18±1.15 b值
2.90±1.56 1.32±1.87 4.99±2.16 4.72±2.65
2.2 SNP位点的筛选
B组和W组DNA混池的PCR产物经测序分析表明，在CHRDL1基因启动子区ATG上游949 bp处发现一个SNP位点（c.-949T>C）。

如
图1 CHRDL1启动子区SNP（c.-949T>C）测序注：B组为10个黑色皮肤个体DNA混池测序图，W组为10个白色皮肤个体DNA混池测序图。

由图1所知，B组和W组SNP位点处测序峰图呈现相反趋势，即双峰（SNP位点）处，左图（B组）红色峰高，表明T基因频率较高；右图（W组）蓝色峰较高，表明C基因频率较高。

2.3 基因型检测与基因及基因型频率统计
2.3.1 基因型的检测
采用AS-PCR技术对个体基因型进行分析，结果如图2所示。

图2中第一条为DNA maker；随后每两个泳道表示同一样本DNA分型结果，第一泳道为C带，第二泳道为T带。

如图2所示依次读为：CT、CC、CT、TT、CT。

图2 CHRDL1启动子区SNP（c.-949T>C）等位基因PCR基因分型检测结果2.3.2 基因及基因型频率统计
如表3所示，本研究选取的120只沐川乌骨黑鸡样本中，CC基因型频率最高（0.368），CT基因型次之（0.328），TT基因型最低（0.304）。

表3 基因及基因型频率统计基因样本数量基因频率基因型频率CHRDL1 120 C T CC CT TT 0.532 0.468 0.368 0.328 0.304
2.4 SNP c.-949T>C与乌骨黑鸡肤色性状和体重的相关性分析
如表4所示，CT基因型个体背部和翅下皮肤肤色L值显著高于CC基因型
（P<0.05），CT基因型个体鸡冠皮肤L和a值极显著高于CC和TT基因型
（P<0.01），CT基因型个体胫色a值显著低于TT基因型（P<0.05）。

由以上数据结果得出SNP c.-949T>C与沐川乌骨黑鸡皮肤黑色沉积具有显著相关性，其中CT基因型背部、翅下和鸡冠的L值显著高于CC基因型（P<0.05或P<0.01），表明杂合子CT个体肤色较浅，CC基因型个体肤色较黑。

各基因型间个体体重无显著差异（P>0.05）。

表4 SNP c.-949T>C与沐川乌骨黑鸡肤色性状和体重的相关性分析注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05），不同大写字母表示差异极显著
（P<0.01），无字母标注表示差异不显著（P>0.05）。

基因型背部翅下鸡冠胫
L值 a值 b值 L值 a值 b值 L值 a值 b值 L值 a值 b值体重CC 53.92±5.59b CT 56.14±5.40a TT 54.60±4.31ab 2.40±0.97B 3.29±1.59A 2.32±0.93B
2.91±1.64b 2.71±1.39a
3.10±1.66b 53.11±
4.12b 54.86±4.16a 52.60±4.00b 2.22±0.94 2.11±0.83 2.09±0.87 1.44±1.76 1.07±2.17 1.44±1.66
41.40±8.34B 47.62±10.14A 39.92±7.84B 3.00±2.19B 5.77±5.28A
3.18±2.29B
4.50±1.94b
5.68±2.65a 4.84±1.63ab 54.61±5.58 55.29±5.73 55.12±5.74 1.12±1.13ab 0.95±1.02b 1.51±1.27a 4.33±2.33b 4.29±2.53b
5.66±2.95a 2.35±0.50 2.36±0.43 2.47±0.50
3 讨论
本研究探讨了CHRDL1基因启动子区变异与其肤色性状的关系。

基因启动子区与RNA聚合酶特异识别、结合，从而控制基因转录的起始时间与程度，所以基因启
动子区的突变能直接影响到基因转录水平或效率。

当基因启动子区发生变异时，由于基因mRNA的表达水平的变化导致相应蛋白水平的变化，从而引起某些特定表型性状发生相应的改变[8-9]。

相关研究表明CHRDL1基因是BMPs基因家族的拮抗剂[2]，而BMPs家族中部分成员在毛囊发育过程中有重要的调节作用。

王小佳
等[10]研究发现BMP4基因在细毛羊肩部的表达量与毛囊密度之间呈显著负相关，毛青青等[11]研究表明小鼠BMP4基因表达与皮肤上的毛囊数量具有显著关系。

上述研究表明CHRDL1基因与皮肤毛囊发育具有显著相关性，进而我们推测CHRDL1基因的表达可能与毛囊中黑色素的合成具有一定相关性。

黑色素广泛存
在于动物皮肤、粘膜等处，具有保护细胞，避免肌肤遭受紫外线伤害的作用，一旦黑色素细胞的新陈代谢受到破坏，就会产生一些如白化症的疾病[12]。

喻世刚等[13]前期采用高通量测序技术分析了黑羽和白羽毛囊转录组，结果表明CHRDL1
基因的mRNA表达与毛囊中黑色素的合成密切相关。

但目前国内外对于CHRDL1
基因在肤色表达方面的研究尚未见报道，CHRDL1基因功能与皮肤黑色素生成和沉积的分子调控机制尚不明确，仍待进一步实验证明。

由于乌骨黑鸡具有极高的药用与营养价值，黑色素沉积易于通过观察其肤色差异而得出，因此在实际销售过程中肤色的乌度能显著影响其销售价格。

消费者普遍认为鸡黑色素沉积越多则其营养价值越高，肤色更乌的鸡具有更大的市场价值，因此，育种中肤色的乌度是乌骨鸡选种选配过程中的一项重要选择指标。

根据上述实验结果，SNP c.-949T>C杂合子CT基因型背部、翅下和鸡冠的L值显著高于CC基因型，表明杂合子CT个体肤色较浅，如采用分子标记辅助选择育种，CT基因型个体应被严格淘汰，而CC基因型个体则应被选择留种。

但CHRDL1基因启动子区变异中杂合子或纯合子肤色差异的分子机制有待于进一步研究。

参考文献：
【相关文献】
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