第一章 细胞的分离与胞内

化学法 酸碱处理 化学试剂处理 酶溶
物理渗透法 渗透压冲击法 冻结－融化法
（一）高压匀浆
高压匀浆又称高压剪切破碎
破碎原理：细胞悬浮液在高 压作用下从阀座与阀之间的 环隙高速喷出后撞击到碰撞 环上，细胞在受到高速撞击 作用后，急剧释放到低压环 境，从而在撞击力和剪切力 等综合作用下破碎。
阀座
阀杆 撞击环 阀杆
按工业应用分类: 1) 管式离心机 2) 碟片式离心机
管式离心机
又称圆筒式离心机，结构较简单
操作时，料液从圆管下端的中心输入，在离心力作用下， 管内液体基本上是以旋转轴为中心的圆筒面，从上端的中 心排出轻相（上清液）。
固液分离（间隙操作）
液液分离（连续操作）
间隙操作时，固体颗粒沉降于管壁；连续操作时， 从管壁附近的出口排出重相（浓缩的悬浮液）
机械破碎中细胞所受的机械作用力：压缩力和剪切 力。
化学破碎又称化学渗透，利用化学或生化试剂（酶） 改变细胞壁或膜的结构，增大胞内物质的溶解速率； 或者完全溶解细胞壁，形成原生质体后，在渗透压 作用下使细胞膜破裂而释放胞内物质。
二、细胞破碎技术
机械破碎法 高压匀浆 珠磨法 喷雾撞击破碎 超声波破碎
（二）珠磨
原理：珠磨机的破碎室内填充玻璃或氧化锆微珠。 在搅拌桨的高速搅拌下微珠高速运动，微珠之间 以及微珠和细胞之间发生冲击和研磨，使悬浮液 中的细胞受到研磨剪切和撞击而破碎。
WSK卧式高效全能珠磨机
优缺点
珠磨破碎操作的有效能量利用率仅为1％左右，破 碎过程产生大量的热能。因此在设计操作时应充 分考虑换热能力问题。
预处理方法
加热：最简单和最廉价的处理方法。黏度 、促凝聚、固 体成分体积 、破坏凝胶结构、增加空隙率
调pH值：方法简单有效、成本低廉
凝聚：在凝聚剂(如铝盐、铁盐、石灰和NaCl)作用下，细 胞蛋白质等胶体去稳定，并聚集成1mm大小的凝聚块的过 程。 机理：破坏双电层，水解后胶体吸附，氢键结合等。
按用途分类：
1)分析性：一般都带有光学系统，主要用于研究 纯的生物大分子和颗粒的理化性质，依据待测物质在 离心场中的行为（用离心机中的光学系统连续监测）， 能推断物质的纯度、形状和分子量等。
分析性离心机都是超速离心机。
2)制备性：主要用于分离各种生物材料，每次分 离的样品容量比较大 。实验室用；工业用
平衡区带离心
平衡区带离心的密度梯度比差速区带离心的密 度梯度高，离心操作的结果使料液中的高分子 溶质在与其自身密度相等的溶剂密度处形成稳 定的区带，区带中的溶质浓度以该密度为中心， 呈Gauss分布。（三） Nhomakorabea心分离设备
按设备所能达到的离心力或离心转数分类： 低速离心机、高速离心机、超速离心机
项目
第一节 细胞分离
细胞分离的目的
（1）胞内目标物的获取：菌体或细胞通过物理 或化学方法处理后释放目标产物，然后除去细胞或 碎片后进一步分离纯化就可得到胞内目标物。
（2）胞外目标物的获取：直接利用生物原料液 或培养液进行分离纯化可得到胞外目标物。
细胞分离的主要技术手段
一、重力沉降 二、离心沉降 三、过滤
采用往复式恒流泵可进行恒速过滤，其间操作压 力不断上升。
（二）悬浮液的预处理
提高过滤速度和过滤质量是过滤操作的目标。
由于滤饼阻力是影响过滤速度的主要因素，因此 在过滤操作前，一般要对滤液进行预处理，改变 料液的物理性质（黏度、颗粒、颗粒稳定性等）， 降低滤饼的阻力，固液分离速度，分离器分离效 率 。
则使两相完全分离的最大处理流量 （即离心机的处理能力）为：
在离心操作中，r1和r2近似相等，上式可简化为
设：
则：
∑具有面积的单位，称为离心沉降面积，是离心机 结构和操作条件的函数。
以上计算的处理能力是理论值，而实际处理能力一般低 于理论值，需乘以一个校正系数ε，实际处理能力：
碟片式离心机
又称分离板式离心机
其中s称为沉降系数?蛋白质的相对分子质量越大沉降系数越大二离心分离方法11差速离心分级22区带离心11差速离心分级差速离心是生化工业中最常用的离心分离方法如以菌体细胞的收集或除去为目的的固液离心分离
第一章 细胞的分离与胞内产物的溶解
第一节 细胞分离(重点） 第二节 细胞破碎 第三节 包涵体的分离和蛋白质的复性
滤饼阻力Rc与滤饼干重W（kg）之间有如下关系：
Rc＝αW/A
式二
式中：α为滤饼的平均比阻，m/kg。 1）不可压缩性滤饼（如坚硬的乳胶粒子）α为常数
2）可压缩性滤饼（如菌体、细胞 ）α＝k△pm；
其中：m为压缩指数，一般在0.3－1.2之间； 对于一定的料液，k为常数。
由此可知，可压缩滤饼的比阻值α随压力提高而增大。在 过滤操作中，一般需缓慢增大操作压力，最终压力不能超过 0.3－0.4MPa
式中： r为离心半径，即从旋转轴心到沉降颗粒的距离； ω为旋转角速度； N为离心机的转数，s－1
分离因子Z定义： 离心设备所能达到的离心力/重力加速度(g)的比值
意义：衡量离心设备的离心程度的重要技术参数， 用于离心机的分类
一般将Zg称作离心力，离心设备的旋转半径越大， 转数越高，离心力越大
固体颗粒离心沉降速度：
过滤介质：
1）无定形颗粒：颗粒活性炭、沙、无烟煤 2）成形颗粒：烧结金属、烧结塑料 3）非金属织物：尼龙、玻璃纤维 4）金属织物：不锈钢丝网 5）无纺品：纸、石棉
（一）过滤基础理论
过滤时滤液的透过速度：
dQ
A△p
dt = μL(Rm+Rc)
式一
式中： Q为滤液体积，m3； A为过滤面积，m2； △p为操作压力，pa； μL为滤液的粘度，pa×s； Rm和Rc分别为介质和滤饼的阻力，m-1
一、重力沉降
概念：指因组成悬浮系的流体和悬浮物具有密度 差，在重力场中发生相对运动，因而得到分离的 沉降操作。
菌体和动植物细胞的重力沉降特点：简便易行； 但菌体细胞体积很小，沉降速度很慢。
因此需使菌体细胞聚并成较大凝聚体颗粒后再进 行沉降操作，提高沉降速度。 措施：加入中性盐、聚丙烯酰胺等高分子絮凝剂
最后把Rc、Rm代入式一，得过滤基本方程： 式四
Ruth恒压过滤方程
恒压操作条件下积分式四，得Ruth恒压过滤方程：
（Q＋Q0）2＝K（t＋t0）
式五
其中
K称为Ruth恒压过滤系数 t0为透过虚拟滤液量Q0所需的虚拟时间
微分式五可得：
恒速过滤
恒压过滤操作中滤饼阻力不断上升，过滤速度不 断下降。
压力控制手轮
APV Manton Gaulin 高压匀浆器针型阀结构简图
适用范围及注意事项
高压匀浆法适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎， 料液细胞质量浓度可达到200g/L。
团状和系状菌易造成高压匀浆器堵塞，不宜使用 高压匀浆法。
高压匀浆过程伴随温度上升，为保护目标产物的 生物活性，需对料液作冷却处理。
絮凝：在絮凝剂高分子聚合电解质的作用下，胶体颗粒和 聚合电解质交连成网，形成10mm大小的絮凝团过程。 絮凝剂：如聚丙烯酰胺、聚二烯丙基四胺、环氧化乙烯。 机理：絮凝剂主要起中和电荷、桥架和网络作用
惰性助滤剂：一种颗粒均匀、质地坚硬的粒状物质，用于 扩大过滤表面的适应范围，减轻细小颗粒的快速挤压变形 和过滤介质的堵塞。 使用方法：预涂层；按一定比率混合。 助滤剂种类：硅藻土、纤维素、未活化的炭、炉渣、重质 碳酸钙等。
低速离心机 高速离心机 超速离心机
转数(r/min) 2000－6000 10000－26000 30000－120000
离心力(g) 2000－7000 8000－80000 100000－600000
适 细胞 适用 应 细胞核 适用 范 细胞器 围 蛋白质
适用 适用 适用
适用 适用 适用 适用
冷冻高速离心机
珠磨法适用于绝大多数微生物细胞的破碎，但与 高压匀浆法相比，影响破碎率的操作参数较多， 操作过程的优化设计较复杂。
（三）喷雾撞击破碎
原理：细胞悬浮液以喷雾状高速冻结，形成粒径 小于500μm的微粒子。高速载气（如氮气）将冻 结的微粒子送入破碎室，高速撞击撞击板，使冻 结的细胞发生破碎。
离心转子中有许多等间隙的碟形分离板，以增大 沉降面积，提高处理能力
操作过程中，料液从中心进料口输入，通过转子 底部的液孔进入分离板外径处，进入分离板的间 隙。轻相通过分离板的间隙向转子上部出口排出。
以连续操作为目的的碟片式离心机设有连续排出 重相（浓缩悬浮液）的喷嘴。连续操作时，重相 从喷嘴连续喷出。
分为：差速区带离心、平衡区带离心
差速区带离心
差速区带离心的密度梯度中的最大密度小于待分 离的目标产物的密度。
离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层， 按不同沉降速率沿管底沉降。离心一定时间后， 沉降的颗粒逐渐分开，最后形成一系列界面清楚 的不连续区带。沉降系数越大，往下沉降的越快， 所呈现的区带也越低。沉降系数较小的颗粒，则 在较上部分依次出现。
利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别，在同 一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相 对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状 不同的粒子分部沉淀。
操作过程中一般是在离心后用倾倒的办法把上清 液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心，分 离出第二部分沉淀，如此往复加高转速，逐级分 离出所需要的物质。
第二节 细胞破碎
许多生物产物在细胞培养过程中保留在细胞内， 如一些胞内酶、大部分外源基因表达产物和植物 细胞产物等。
这些产物在收集菌体或细胞后，需破碎细胞， 使目标产物选择性地释放到液相。破碎的细胞或 其碎片去除后，上清液用于进一步的分离纯化。
一、细胞破碎和产物释放原理
细胞破碎主要采用各种机械破碎法和化学破碎法， 或两种方法结合。
式中：dp为固体颗粒粒径 ρs为固体密度 ρL为液体密度 μL为液体粘度
Vs还可用下式表示： 其中S称为沉降系数
蛋白质的相对分子质量越大，沉降系数越大
（二）离心分离方法
（1）差速离心分级 （2）区带离心
（1）差速离心分级
差速离心是生化工业中最常用的离心分离方法
如以菌体细胞的收集或除去为目的的固液离心分离；菌体 和细胞一般在500-5000g的离心力下就可完全沉降；工业 规模的离心操作中，为提高分离速度，所用离心力较大。
随着过滤操作的进行，滤饼干重w不断增加，与滤液体积Q 之间有如下关系：
w＝ρLQcs/(1-βcs)
式三
式中：ρL为滤液密度；
cs为料液中形成滤饼的固形成分含量；
β为湿滤饼和干滤饼的质量比
将式三代入式二，得到Rc的表达式：
同时Rm用相同形式表达：
式中：Q0为形成相当于过滤介质阻力的滤饼时透过的虚拟滤 液体积，特定过滤介质的Q0值为常数
固体颗粒匀速沉降时的沉降速度为 dp2（ρS－ρL）g
vg＝ 18μL
其中：dp为固体颗粒粒径； ρS为固体密度； ρL为液体密度； g为重力加速度，9.81； μL为液体粘度
二、离心沉降
（一）离心分离原理 （二）离心分离方法 （三）离心分离设备
（一）离心分离原理
离心沉降是在离心力的作用下发生的 单位质量的物质所受到的离心力：
操作中，根据实际物系的特点（目标产物和其 他组分的性质和相互作用等）、分离的目的和所需 分离的程度，选择适当的操作条件（离心转数和时 间），可使料液中的不同组分得到分级分离。
（2）区带离心
用于蛋白质、核酸等生物大分子的分离纯化，但 处理量小，一般仅限于实验室水平。
方法：事先在离心管中用某种低分子溶质（如蔗 糖、CsCl、NaBr溶液）调配好密度梯度，在密 度梯度之上加待处理的料液后进行离心操作。
特点：碟片式离心机结构复杂，离心转速一般较 管式离心机低，但沉降面积大，处理能力强。
离心设备的选择
基本参数 颗粒d,固液差,
选择 基本型号
固体物浓度
亚型
产物热稳定性
低温离心
流量Q, 规模
规格、台数
活cell
密封灭菌设计
三、过滤
定义：利用薄片形多孔性介质（如滤纸）截留固 液悬浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法称 为过滤（filtration）。
应用：液-液分离(连续式)； 低固体含量(<1%)的固-液分离(间歇式)
优点：结构简单，价廉； 分离效果好，分离因子高（8000－15000g）
缺点：沉降面积小，处理能力有限； 低固体含量的悬浮液(<1%)
设管长为L； 离心机的旋转轴心到液面的距离为r1； 转筒内径为r2； Vg为粒子的重力沉降速度
（四）过滤设备
生化工业中常用的过滤设备主要有加压叶滤机、 板框过滤机、旋转真空过滤机等。 如何选择过滤器？
1、滤液的澄清度 2、颗粒大小的分布 3、发酵液的黏度 4、固体颗粒的浓度 5、滤饼的干燥度 6、滤饼的洗涤 7、生产能力
Filting medium
Type of Filter Other requirements