缢蛏生长因子受体结合蛋白2基因克隆、时空表达及SNP筛查

缢蛏生长因子受体结合蛋白2基因克隆、时空表达及SNP筛
查
赵家熙;崔宝月;董迎辉;姚韩韩;林志华
【摘要】To explore the molecular structure and biological function of GRB2 in Sinonovacula constricta (ScGRB2),its cDNA was cloned by SMART RACE techniques,then the bioinformatics,SNPs in exon and expression profiles in different tissues and developmental stages were analyzed.The results indicated that the full length cDNA of Sc-GRB2 gene was 1 223
bp,containing a complete 711 bp ORF encoding 236 amino
parisons of animal acid sequence,Sc-GRB2 has high homology with bivalves of Meretrix meretrix and Tegillarca granosa (64 ％ and
59 ％).Sc-GRB 2 has homologous with others share 45 ％-58 ％0 similarity,it indicate GRB 2 is relatively conservative.The result of qRT-PCR
in different tissues showed that Sc-GRB2 expressed in all seven tissues,the expression of foot was extremely significantly higher than others (P＜
0.01).The relative expression in different stages revealed that the expression of juvenile clams was extremely significantly higher than other stages (P＜ 0.01).A total of 11 SNPs in the exon of Sc-GRB2 were identified.%为了探索生长因子受体结合蛋白2 (GRB2)在缢蛏生长发育中的作用,本实验基于缢蛏转录组文库,利用SMART RACE技术克隆缢蛏GRB2(Sc-GRB2)基因的cDNA
全长序列,分析其在不同组织和发育时期的表达差异,并在外显子中进行了SNP位点筛选.结果表明,Sc-GRB2基因cDNA全长1 223 bp,开放阅读框711 bp,编码236个氨基酸;氨基酸序列比对发现,缢蛏与文蛤、泥蚶等双壳贝类同源性较高(64％00、
59％),而与其他物种的同源性为45％～58％,表明GRB2基因比较保守;不同组织的荧光定量PCR (qRT-PCR)结果显示,Sc-GRB2基因在缢蛏7个组织中均有表达,其中足中的表达量极显著地高于其他6个组织(P＜0.01);在8个发育时期的表达差异分析发现,该基因在稚贝期表达量极显著地高于其他7个时期(P＜0.01).SNP位点筛选结果表明,在Sc-GRB2基因的外显子区域共发现11个SNP位点.
【期刊名称】《海洋学报（中文版）》
【年(卷),期】2018(040)002
【总页数】8页(P87-94)
【关键词】缢蛏;生长因子受体结合蛋白2;克隆;SNP
【作者】赵家熙;崔宝月;董迎辉;姚韩韩;林志华
【作者单位】浙江万里学院浙江省水产种质资源高效利用技术研究重点实验室,浙江宁波315100;上海海洋大学水产与生命学院,上海201306;浙江万里学院浙江省水产种质资源高效利用技术研究重点实验室,浙江宁波315100;浙江万里学院浙江省水产种质资源高效利用技术研究重点实验室,浙江宁波315100;浙江万里学院浙江省水产种质资源高效利用技术研究重点实验室,浙江宁波315100
【正文语种】中文
【中图分类】P917.4
1 引言
生长因子受体结合蛋白2 (growth factor receptor-bound protein 2， GRB2)，是一种重要的接头蛋白，它通过对上游受体激酶的调控参与各类细胞的信号转导，
从而影响细胞的增殖、生长、分化[1-3]。

GRB2蛋白由3个结构域SH3-SH2-SH3构成，SH2与SH3结构域通过柔性链臂连接可增强GRB2蛋白的空间结构变化以及信号传导过程的接头作用[4]。

SH2能识别并结合富含磷酸化酪氨酸残基的蛋白；SH3可与鸟嘌呤核苷酸交换因子(SOS)结合，激活鸟苷三磷酸 (GTP)传递外界信号至细胞核内[5-6]。

在高等动物中，已有研究证明GRB2 基因在调控生长、胚胎发育等相关信号通路中发挥重要作用[7-8]。

在海洋贝类中，已克隆出泥蚶(Tegillarca granosa)、文蛤(Meretrix meretrix)GRB2基因cDNA全长，并发现该基因在各个组织与发育时期均有表达，且在文蛤的外显子中筛选到16个SNP 位点[9-10]。

缢蛏(Sinonovacula constricta)是我国四大养殖贝类之一，在浙、闽地区养殖已有数百年历史，具有较高的经济价值和生态价值[11]。

近年来，虽然缢蛏人工育苗和养殖产业发展迅速，但目前人工养殖中尚无遗传改良的新品种，存在生长、抗逆等生产性状退化的潜在风险，因此研究缢蛏生长相关基因对开展分子辅助育种、推动缢蛏养殖业持续健康发展具有重要意义。

目前，有关缢蛏生长相关基因的研究，已有铁蛋白(ferritin)[12]、类胰岛素生长因子结合蛋白(IGFBP)[13]等见诸报道。

本实验克隆得到缢蛏GRB2(Sc-GRB2)基因cDNA全长序列，分析其在不同组织和不同发育时期的表达规律，筛选外显子中SNP 位点，初步解析该基因在缢蛏生长发育过程中的作用，为筛选生长相关候选基因和研究生长调控的分子机制奠定基础。

2 材料和方法
2.1 实验材料
实验用缢蛏取自宁波市鄞州丹艳水产养殖基地，活体解剖获得闭壳肌、肝胰腺、外套膜、足、鳃、水管和血液7个组织，液氮速冻，置于-80℃冰箱保存，用于RNA提取。

取性腺发育成熟的缢蛏亲贝，通过催产、人工授精和幼体培育获得同步发育的8个发育时期的样品(未受精卵、受精卵、2细胞胚胎、4细胞胚胎、囊
胚、担轮幼虫、D形幼虫和稚贝)。

取同批繁殖、同塘养殖的缢蛏群体700颗，随机取样115颗测量壳长、壳宽、壳高、活体质量和软体质量等生长性状，并活体
解剖取足，经液氮速冻后放-80℃冰箱保存。

2.2 实验方法
2.2.1 Sc-GRB2基因cDNA全长克隆
提取缢蛏足总RNA，SMARTTM RACE cDNA Amplication Kit试剂盒(Clontech)合成cDNA第一链，作为全长序列快速扩增(RACE)的模板。

利用缢蛏转录组文库
获得Sc-GRB2基因EST片段，设计3′和5′特异性引物GRB2-F和GRB2-R (表1)，进行3′和5′-RACE扩增，对PCR产物割胶回收、连接转化到T1大肠杆菌中，培养过夜，挑选白斑，经验证将阳性克隆进行测序。

为验证Sc-GRB2基因cDNA全长，用克隆得到的cDNA全长设计引物G-F1和
G-R1(表1)进行PCR扩增，产物回收、纯化、克隆步骤同上。

表1 实验所用引物及其序列Tab.1 Primers and sequences of the experiments 引物序列引物信息
GRB2⁃FGAATACCATCGGAAGTCCTCGGTCAGTC3′⁃RACEGRB2⁃RCCATCTGG GTGAATGAACTT GTCGTCGG5′⁃RACEG⁃F1ATACGCAAAACCAATATGGAGGC
全长验证G⁃R1AGAGGCAGTAATAACACAAGACAGG全长验证
R⁃G⁃FCCAACTGACAGACAACAGGTAGAAqRT⁃PCRR⁃G⁃RAGATGTTAGCGTCC TGGATTGCqRT⁃PCR18S⁃FTCGGTTCTATTGCGTTGGTTTTqRT⁃PCR18S⁃RCAG TTGGCATCGTTTATGGTCAqRT⁃PCRS⁃GRB2⁃F1GGGGATACGCAAAACCAATA SNP筛选S⁃GRB2⁃R1GAGGCAGTAATAACACAAGACAGGSNP筛选
2.2.2 Sc-GRB2基因的序列及进化分析
利用BLAST软件拼接5′和3′-RACE片段序列，获得Sc-GRB2基因cDNA全长；使用DNAMAN6.0预测其氨基酸序列以及理化性质；ORF Finder预测Sc-GRB2
基因的开放阅读框；Clustal X进行氨基酸多序列比对；利用ExPASy软件推测该蛋白理化性质；Smart软件进行蛋白质功能域预测；利用TMHMM和SignalP分别进行蛋白质跨膜区和信号肽区域分析；使用Swiss Model软件进行蛋白质高级结构预测；MEGA 6.0软件的NJ法构建系统进化树。

2.2.3 Sc-GRB2基因不同组织和发育时期的表达差异分析
取缢蛏不同组织和发育时期样品，提取RNA并反转录合成cDNA，作为荧光定量PCR(qRT-PCR)的模板，用Primer 5设计引物R-G-F和R-G-R (表1)，内参为18S rRNA基因，用7500 Fast Real-Time PCR仪进行荧光定量PCR反应。

采用相对值2-△△Ct进行数据处理，SPSS 17.0对不同组织和发育时期的荧光定量结果进行差异分析。

2.2.4 Sc-GRB2基因外显子SNP位点筛选
取上述随机选取的115颗缢蛏样品，提取RNA后按照反转录试剂盒(TAKARA)合成cDNA。

以Sc-GRB2基因cDNA全长为模板设计引物S-GRB2-F1、S-GRB2-R1(表1)进行PCR扩增，产物直接送公司测序。

测序结果用MEGA6.0软件进行序列比对，查找到的SNP位点用SPSS 17.0进行生长相关性分析。

3 结果
3.1 Sc-GRB2基因cDNA全长克隆和序列分析
Sc-GRB2基因cDNA全长1 223 bp(GenBank登录号：KX197929.1)，开放阅读框711 bp，编码236个氨基酸。

包含终止密码子ATG，加尾信号ATTAAA及27 bp长的polyA尾(图1)。

图1 Sc-GRB2基因的 cDNA 全长序列及其推导的氨基酸序列Fig.1 The full length of cDNA and deduced amino acid sequence of Sc-GRB2 gene阴影代表polyA，加框代表 Sc-GRB2 基因的加尾信号、起始密码子和终止子，单下划线部分代表SH3功能区，双下划线部分为SH2功能区，*代表蛋白翻译结束The
shaded gray represents polyA. The three letters boxes are polyadenylation signal sequence， the start codon and the stop codon. The bold underlined parts are the functional domains of SH3. The double line is the functional domains of SH2. The * represents the end of the protein translation
ExPASy Compute 软件推导出Sc-GRB2蛋白的分子质量27.44 ku，等电点
pI=6.99；TMHMM 软件和SignalP 软件预测该蛋白质无跨膜区和信号肽；ExPASy Protscale 软件预测显示，该蛋白质含有较大比例的极性氨基酸，表现为
亲水性。

功能域预测结果表明，Sc-GRB2蛋白存在3个结构域：SH3(8-64aa)-SH2(65-155aa)-SH3(177-234aa)。

Swiss model软件预测显示，Sc-GRB2蛋白的二级结构由4个α-螺旋、136个H键、20个β-折叠片和25个转角构成，两个α-螺旋
分别分布在SH2两端，每个SH3 结构域各有1个α-螺旋并且大多由β-折叠组成。

利用 MEGA6.0 软件，对缢蛏和其他12个物种的氨基酸序列进行了序列比对和系统进化树分析(图2)。

结果表明，Sc-GRB2基因与文蛤和泥蚶等双壳贝类同源性较高，分别为64%和59%，与日本血吸虫(Schistosoma japonicum，
CAX70561.1)、细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus，CDS18126.1)、科罗
拉多甲虫(Leptinotarsa decemlineat，ALE20585.1)、尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus，XP_003443139.1)、斑马鱼(Danio rerio， NP_998200.1)、大西洋鲑(Salmo salar， NP_001158778.1)、北美绿蜥蜴(Anolis carolinensis，
XP_003217258.1)、鸡(Gallus gallus，NP_989742.1)、小家鼠(Mus musculus，NP_989742.1)、人(Homo sapiens， CAG29359.1)等动物的同源性为45%～58%。

进化树分析表明，缢蛏与软体动物、昆虫类等无脊椎动物的亲缘关系较近，而与哺乳动物、爬行类、鱼类、鸟类等脊椎动物的亲缘关系较远。

图2 采用MEGA6.0软件NJ法构建的进化树 Fig.2 The phylogenetic tree constructed by MEGA6.0 software using NJ method
3.2 Sc-GRB2基因在缢蛏不同组织和不同发育时期的表达差异分析
qRT-PCR检测结果显示，Sc-GRB2基因在缢蛏成贝7个组织和8个发育时期中
均有表达。

组织差异性表达结果表明，足中表达量最高，且极显著地高于其他6
个组织 (P<0.01)，其次血液中的表达量也较高(图3)。

不同发育阶段结果表明，
Sc-GRB2基因在缢蛏稚贝之前的表达量很低，而在稚贝期表达量最高，并极显著
地高于其他发育时期(P<0.01) (图4)。

图3 Sc-GRB2基因在缢蛏不同组织的表达分析(n=3) Fig.3 Expression of Sc-GRB2 gene in different tissues of S. constricta (n=3)1. 肝胰腺，2.闭壳肌，3.鳃， 4.水管，5.外套膜，6.足，7.血液，**代表极显著差异， P<0.011. Digestive gland， 2.adductor muscle， 3. gill， 4. siphon， 5. mantle， 6. foot， 7. blood， ** represents extremely significant differ-ences， P<0.01
图4 Sc-GRB2基因发育时期表达分析(n>500)Fig.4 Analysis of relative expression of GRB2 gene in early developmental stages of S. constricta (n>500)1.未受精卵，2.受精卵，3.2细胞胚胎，4.4细胞胚胎，5.囊胚，6.担轮幼虫，7.D形幼虫，8.稚贝，**代表极显著差异， P<0.011.Unfertilized mature eggs， 2. fertilized eggs， 3.2-cell embryos， 4.4-cell embryos， 5. blastula， 6. trochophore， 7. D-shaped larva， 8. juvenile clams，
**represents extremely significant differences，P<0.01
3.3 Sc-GRB2基因外显子SNP位点筛选
Sc-GRB2基因外显子区域SNP位点分析发现，共存在11个SNP突变位点(表2)，其中9个位点属于个体随机突变，突变率较低，而611 A>G、857 C>T两个位点的突变率较高，分别为46%和34.7%。

生长相关性分析表明，这些突变位点都没
有在群体中表现出显著差异性，与生长性状不相关。

表2 Sc-GRB2基因外显子序列 SNP 位点统计Tab.2 Statistics result of SNPs in exon of Sc-GRB2位置出现次数/次百分比/%95C>A32
6%386G>A1513%539G>A32 6%611A>G5346%
续表2位置出现次数/次百分比/%765T>A97 8%857C>T4034 7%893A>G32 6%901C>G1613 9%956T>C54 3%984G>T43 5%1039G>T76．1%
4 讨论
生长因子受体结合蛋白2，是一种通过转导多种信号通路来调控细胞生长、增殖和分化的接头蛋白[14-15]，在贝类的泥蚶[9]和文蛤[10]中有过报道。

本实验克隆得到的Sc-GRB2基因编码236个氨基酸，与无脊椎动物中泥蚶(236个)、文蛤(223个)、日本血吸虫(234个)、细粒棘球绦虫(244个)、可多罗拉甲虫(211个)的编码氨基酸数比较发现，GRB2基因在较低等的无脊椎动物中有一定变异，而在脊椎动物的鱼纲、爬行纲、鸟纲和哺乳纲中GRB2基因编码氨基酸数都稳定在217个，推测其功能较为相似。

GRB2蛋白的SH2结构域与SH3结构域紧密结合[4]，其中SH3结构域由5或6个β折叠排列紧凑形成反平行结构，可特异结合其他蛋白富含pro和PXXP为核心的保守结合基序，激活相应细胞信号转导通路[16-18]。

该蛋白C末端的SH3结构域能与Gab1蛋白结合，激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-Akt信号通路影响细胞增殖和生长[19]；SH2结构域中间的β-折叠与两侧的两个α-螺旋形成扁平半球状，可结合相关蛋白的酪氨酸磷酸化区域pYXNX以及非受体酪氨酸激酶发挥作用[20-22]。

缺失SH2结构域的GRB2 (GRB3-3剪接体)可抑制细胞增殖 [23]。

本研究推导出Sc-GRB2蛋白的结构域由SH3-SH2-SH3构成，SH2结构域由中间的β-折叠与两端的2个α-螺旋组成，SH3结构域主要由β-折叠形成的“桶状”结构和1个α-螺旋组成，这与高等动物中的结构相同；进一步的序列同源性分析发现，缢蛏SH2结构域与泥蚶、文蛤的同源性较高(70%、
68%)，与脊椎动物的SH2结构域氨基酸序列的同源性为63%～64%，这表明Sc-GRB2基因在进化过程中较为保守，由此推测在缢蛏体内发挥的作用可能与高等动物相似。

GRB2蛋白发挥作用主要通过与Sos、Vav和Shc等蛋白相互作用得以传递信号来调节各种胞内代谢活动[24-25]。

在高等动物和海洋贝类的研究中，都发现该基因在各组织中均有表达[9-10，14]。

本研究表明，Sc-GRB2基因在缢蛏各个组织中均有表达，其中足的表达量最高，且血液的表达量也处于较高水平，其中足相对于其他组织呈极显著差异(P<0.01)。

该结果与泥蚶Tg-GRB2基因的组织表达规律有相似之处，董迎辉等[9]研究发现Tg-GRB2基因在血液中表达量最高，认为GRB2基因以血液为载体发挥代谢调节、免疫调节等功能。

另外，有研究显示GRB2基因调控的MAPK通路对脂肪、葡萄糖代谢具有调节作用，也能与Gab1结合激活PI3K-Akt信号通路影响细胞的增殖、生长[20，24]。

而缢蛏的足作为主要的运动器官，具有很强的钻洞掘穴能力，细胞代谢旺盛，因此该基因在足部表达量最高或与此有关。

GRB2基因在物种间较为保守，为胚胎正常发育所需[26]。

在小鼠的研究中发现，GRB2基因的低表达会导致小鼠心血管发育异常，敲除GRB2基因的小鼠早期胚胎会出现致死现象，而使用GRB2的SH2结构域则可代替Ras挽救致死胚胎[26-27]；亚等位基因实验还发现，GRB2基因在小鼠胚胎发育过程中具有促进上皮细胞形成以及血管生成等功能[28]。

此外，GRB2作为接头蛋白参与FGF-ERK1 (Fibroblast growth factor-Extracellular signal-regulated kinase 1，成纤维细胞生长因子-细胞外信号调节激酶)信号通路，调控FGF控制内、中胚层细胞的分化响应[29-30]。

刘阳[31]敲低GRB2基因后，发现该基因低表达会导致FGF信号下游转录因子表达降低，阻碍胚层形成。

Fulvio等[32]在非洲绿猴(Cercopithecus aethiops)的RNAi实验中也发现，降低细胞内GRB2基因的表达
会抑制细胞增殖。

本实验结果显示，GRB2基因在缢蛏的未受精卵、受精卵、2细胞胚胎、4细胞胚胎、囊胚期、担轮幼虫、D形幼虫、稚贝等8个时期均有表达，其中稚贝期极显著高于其他时期(P<0.01)，这与文蛤Mm-GRB2基因不同发育时
期的表达特征相似[10]，可能由于缢蛏稚贝期是生长旺盛的时期，各组织快速发育，体内新陈代谢、细胞分裂加速，而GRB2基因的大量表达对细胞的增殖、生长和
分化有明显促进作用[2，33]。

SNP是指在基因组上单个核苷酸的变异，一些位点与生长、抗逆、抗病等经济性
状相关联。

在海洋贝类中已有相关研究报道，如Bao等[34]在泥蚶血红蛋白基因(Hb)中发现了与免疫相关的 SNP 位点；谢淑媚等[13]在缢蛏IGFBP基因的2136 bp处筛选到1个与生长相关的SNP位点；高晓艳等[10]在文蛤HDAC1基因在外显子中发现了3个生长相关的SNP位点。

本实验在Sc-GRB2基因外显子中共筛
选到11个SNP突变位点，其中9个位点属于随机突变位点，而611 A>G和
857 C>T两个位点也属于同义突变，检测到3个基因型，但这3个基因型的生长
数据没有呈现显著差异(P>0.05)，表明缢蛏GRB2基因的外显子变异对其生长性
状无显著影响。

在缢蛏的启动子和内含子中是否会有与生长相关的SNP位点，有
待后续研究验证。

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