夏天无保护四氯化碳(CCl4)所致急性肝损伤的作用及机制[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011213847.X
(22)申请日 2020.11.04
(71)申请人 江西中医药大学
地址 330000 江西省南昌市湾里区梅岭大
道1688号
(72)发明人 龚千锋　严丽萍　于欢　温柔　
李潮　
(74)专利代理机构 合肥律众知识产权代理有限
公司 34147
代理人 龙海丽
(51)Int.Cl.
A61K 36/66(2006.01)
A61P 1/16(2006.01)
(54)发明名称
夏天无保护四氯化碳（CCl4）所致急性肝损
伤的作用及机制
(57)摘要
本发明公开了夏天无保护四氯化碳（CCl4）
所致急性肝损伤的作用及机制,包括以下步骤：
小鼠随机分为正常组、模型组、阳性组及醋炙高、
中、低剂量组，连续灌胃给药7 d后，除正常组小
鼠腹腔注射食用油外，其他各组小鼠以0.1g/ml
浓度腹腔注射0.4%CCl4食用油溶液，建立急性肝
损伤模型。

造模24 h后，眼球取血，离心收集血清
和肝脏组织。

测定血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草
转氨酶(AST)活性、肝匀浆中超氧化物歧化酶
(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH ‑Px)的活力、丙
二醛(MDA)含量，以及肿瘤坏死因子‑α(TNF ‑
α)、白细胞介素‑6(IL ‑6)的表达水平，计算肝脏
指数并观察肝组织病理变化。

醋炙夏天无能有效
改善CCl4致小鼠慢性肝损伤，其作用机制可能与
抗氧化作用相关，为后期的开发利用提供科学依
据。

权利要求书1页 说明书6页 附图3页CN 112245473 A 2021.01.22
C N 112245473
A
1.夏天无保护四氯化碳（CCl4）所致急性肝损伤的作用及机制，其特征在于：包括以下步骤：
S1.小鼠随机分为正常组、模型组、阳性组及醋炙高、中、低剂量组；
S2.除正常组和模型组灌胃给生理盐水外，其他各组给予相应的药物，连续灌胃7天，每天一次；
S3.连续灌胃给药7d后，最后一次给药后相隔6小时，除正常组小鼠腹腔注射食用油外，其他各组小鼠腹腔注射(ip)0.4%CCl4食用油溶液，禁食不禁水，建立急性肝损伤模型；
S4.造模24h后，眼球取血，离心收集血清和肝脏组织，测ALT、AST、肝匀浆中SOD、MDA，TNF -α以及IL -6，每只小鼠测定肝脏指数(肝脏的重量/体重*100%)；
S5.从肝左叶相同部位取适量肝组织，加5mL 0.85%的生理盐水，制备肝组织匀浆，测定血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性、肝匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH -Px)的活力、丙二醛(MDA)含量，以及肿瘤坏死因子-α(TNF -α)、白细胞介素-6(IL -6)的表达水平，计算肝脏指数并观察肝组织病理变化。

2.根据权利要求1所述的夏天无保护四氯化碳（CCl4）所致急性肝损伤的作用及机制，其特征在于：所述S1中小鼠随机分配阳性组中使用联苯双酯，并且联苯双酯的剂量为
1.2g ·kg -1。

3.根据权利要求1所述的夏天无保护四氯化碳（CCl4）所致急性肝损伤的作用及机制，其特征在于：所述S1中醋炙高、中、低三个剂量组的剂量分别为1.8g ·kg -1、1.5g ·kg -1、0.9g ·kg -1。

4.根据权利要求1所述的夏天无保护四氯化碳（CCl4）所致急性肝损伤的作用及机制，其特征在于：所述S3中除正常组小鼠外的其他各组小鼠以腹腔注射0.4%CCl4食用油溶液的给药用量为0.1ml/10g。

权　利　要　求　书1/1页CN 112245473 A
夏天无保护四氯化碳（CCl4）所致急性肝损伤的作用及机制
技术领域
[0001]本发明涉及急性肝损伤技术领域，具体为夏天无保护四氯化碳（CCl4）所致急性肝损伤的作用及机制。

背景技术
[0002]夏天无系罂粟科植物伏生紫堇(Corydalis decumbens(Thunb.)Pers.的干燥块茎，常见的民间中药材，具有活血通络、行气止痛的功效；现代药理学研究表明，夏天无具有抗心脑血管系统疾病、抗炎镇痛、抗肝损伤等作用。

[0003]有文献报道夏天无具有保肝作用，其醋炙品尚未进行研究，本文主要探究醋炙夏天无对CCl4所致急性肝损伤效果是否具有统计学意义，进一步为醋炙入肝的提供科学依据，所以我们提出了夏天无保护四氯化碳（CCl4）所致急性肝损伤的作用及机制。

发明内容
[0004]本发明的目的在于提供夏天无保护四氯化碳（CCl4）所致急性肝损伤的作用及机制，探究醋炙夏天无对CCl4所致急性肝损伤效果是否具有统计学意义，进一步为醋炙入肝的提供科学依据。

[0005]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：夏天无保护四氯化碳（CCl4）所致急性肝损伤的作用及机制，包括以下步骤：
S1.小鼠随机分为正常组、模型组、阳性组及醋炙高、中、低剂量组。

[0006]S2.除正常组和模型组灌胃给生理盐水外，其他各组给予相应的药物，连续灌胃7天，每天一次。

[0007]S3.连续灌胃给药7d后，最后一次给药后相隔6小时，除正常组小鼠腹腔注射食用油外，其他各组小鼠腹腔注射(ip)0.4%CCl4食用油溶液，禁食不禁水，建立急性肝损伤模型。

[0008]S4.造模24h后，眼球取血，离心收集血清和肝脏组织，测ALT、AST、肝匀浆中SOD、MDA，TNF-α以及IL-6，每只小鼠测定肝脏指数(肝脏的重量/体重*100%)。

[0009]S5.从肝左叶相同部位取适量肝组织，加5mL 0.85%的生理盐水，制备肝组织匀浆，测定血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性、肝匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活力、丙二醛(MDA)含量，以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的表达水平，计算肝脏指数并观察肝组织病理变化。

[0010]优选的，所述S1中小鼠随机分配阳性组中使用联苯双酯，并且联苯双酯的剂量为1.2g·kg-1。

[0011]优选的，所述S1中醋炙高、中、低三个剂量组的剂量分别为1.8g·kg-1、1.5g·kg -1、0.9g·kg-1。

[0012]优选的，所述S3中除正常组小鼠外的其他各组小鼠以腹腔注射0.4%CCl4食用油溶液的给药用量为0.1ml/10g。

[0013]与现有技术相比，本发明的有益效果是：该夏天无保护四氯化碳（CCl4）所致急性肝损伤的作用及机制，与模型组相比，醋炙夏天无组能显著降低小鼠血清中ALT和AST水平(P<0.01)，增强肝组织中SOD、GSH-PX活性(P<0.01)，降低肝组织中MDA含量以及TNF-α、IL-6的水平(P<0.01)，差异具有统计学意义，此外，还能减轻CCl4对肝脏的病理损伤和肿胀度，因此，醋炙夏天无能有效改善CCl4致小鼠慢性肝损伤，其作用机制可能与抗氧化作用相关，为后期的开发利用提供科学依据。

附图说明
[0014]图1为本发明小鼠肝脏正常组病理切片结果示意图；
图2为本发明小鼠肝脏模型组病理切片结果示意图；
图3为本发明小鼠肝脏阳性组病理切片结果示意图；
图4为本发明小鼠肝脏生品组病理切片结果示意图；
图5为本发明小鼠肝脏醋炙组病理切片结果示意图。

具体实施方式
[0015]1 材料
1.1药品与试剂
夏天无由江西省分宜县金贝农业科技发展有限公司提供，联苯双酯购自万邦德制药集团股份有限公司，四氯化碳购自天津市大茂化学试剂厂，食醋购自北京北京二商龙和食品有限公司，丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬酸氨基转移酶(AST)、氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)试剂盒均购自上海酶联有限公司，批号分别是LOT20191203A、LOT20191203A、LOT20191209A、LOT20191203A、LOT20191211A、LOT20191211A、LOT20191211A；其他试剂均为分析纯。

[0016] 1.2 动物
SPF级昆明种小鼠，雌雄各半，体重18
~22g，由江西中医药大学实验动物中心提供，许可
证号:SCXK(赣)2018-0003。

动物质量合格证号：0001942。

常温环境下饲养，一周后，分组塑料笼饲养。

给予大小鼠生长繁殖饲料，自由饮水和进食。

饲料生产于武汉市万千佳兴生物科技有限公司，许可证号:SCXK(鄂)20166-0011。

[0017] 1.3仪器
SQP型电子天平（万分之一，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；YB502N电子天平（百分之一，上海海康电子仪器厂）；电热恒温培养箱(武汉一恒苏净科学仪器有限公司)；TG16W 台式微量高速离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；PRECISA电子分析天平(瑞士，型号-XB220A）；细胞破碎仪（EasyWeLL系列JY98-IIIN型号）；HT-111B恒温摇床（上海赫田科学仪器有限公司），Rayto酶标仪（RT-6100，深圳雷杜有限公司）；全自动研磨仪（武汉赛维尔生物有限公司），全自动生化分析仪Chemray800（深圳雷杜生命科技有限公司）。

[0018]2 方法
2.1动物分组、模型与给药
将60只小鼠随机分为6组，正常组，模型组、阳性组，醋炙夏天无高、中、低剂量组，除正常组和模型组灌胃给生理盐水外，其他各组给予相应的药物，连续灌胃7天，每天一次，最后
一次给药后相隔6小时腹腔注射(ip)0.4%CCl4食用油溶液，给药用量0.1ml/10g，禁食不禁水，24h后摘眼球取血，测ALT、AST、肝匀浆中SOD、MDA，TNF-α以及IL-6，每只小鼠测定肝脏指数(肝脏的重量/体重*100%)。

从肝左叶相同部位取适量肝组织，加5mL 0.85%的生理盐水，制备肝组织匀浆，测肝组织匀浆MDA含量、SOD活力、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及白细胞介素-6(IL-6)的表达水平。

[0019] 2.2肝脏指数的测定
小鼠摘眼球取血，处死后取出肝脏，称重，计算肝脏指数。

[0020]肝脏指数=[肝脏重量(g)/体重(g)]×100%
2.3生化指标测定
小鼠眼球取血，静置1h，10000r·min-1离心15min，取血清，用赖氏法测定血清ALT，AST 的含量；按照试剂盒的说明分别测定小鼠血清中ALT和AST的含量。

称取肝脏相同部位的肝组织，加入0.9%生理盐水制备10%肝匀浆，按照试剂盒说明，测定SOD、MDA、GSH-PX的含量。

[0021] 2.4测定TNF-α、IL-6的表达
按2.1中方法制备肝组织匀浆，按所购ELISA试剂盒说明书操作，测定肝组织中TNF-α、IL-6的含量。

[0022] 2.5病理观察
取小鼠相同部位肝组织，用10%甲醛固定，制作肝组织切片，HE染色，光镜下观察其病变，拍照。

[0023] 2.6统计学处理
利用SPSS23.0软件进行数据分析，所有数据均以表示，组间采用方差分析，方差性
检验齐时，采用LSD法，不齐时采用Dunnett’s T3法，以P<0.05表示差异具有统计学意义。

[0024]3结果与分析
3.1醋炙夏天无提取物对肝脏指数、血清ALT，AST的影响
模型组与正常组对照，血清中AST、ALT含量明显升高，表明造模成功；与模型组相比，醋炙组高、中剂量差异显著，具有统计学意义（P<0.01)，与生品组相比，无明显差异（P>0.05)；醋炙组与阳性对照组比较，差异不大（P>0.05)，结果说明醋炙夏天无抑制血清中AST、ALT水平增高效果显著，醋炙夏天无与阳性药物组效果相近，醋炙中、高剂量组效果尤为显著，生品组没有显著差异；肝脏指数结果表明，模型组肝脏系数明显增大，给药后肝脏系数降低，可能对肝脏轻度肿胀有一定的缓解作用，结果见表1。

[0025]表1 夏天无对CCl4致急性肝损伤小鼠血清ALT和AST的影响(，n=10)
注:与正常组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01
3.2醋炙夏天无提取物对肝组织SOD、MDA、GSH-PX的影响
与正常组相比，模型组中小鼠肝脏MDA含量明显升高，SOD、GSH-PX活力明显降低，说明造模成功。

与模型组对照，醋炙高剂量组均能明显降低MDA含量，增强SOD和GSH-PX的活性，差异具有统计学意义(P<0.01)；生品组与模型组相比，生品高剂量组能显著升高MDA含量，降低GSH-PX活力，对SOD影响不大，结果见表2。

[0026]表2 夏天无对CCl4致急性肝损伤小鼠肝组织SOD、MDA和GSH-PX的影响(，n=10)
注:与空白对照组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01
3.3醋炙夏天无提取物对肝脏炎症因子TNF-α、IL-6的影响
与正常组相比，模型组中小鼠肝脏炎症因子TNF-α、IL-6含量明显升高，说明造模成功。

与模型组相比，醋炙各剂量组、生品高剂量组小鼠肝脏中TNF-α含量降低效果最为显著(P< 0.01)，醋炙、生品中高剂量组能明显降低IL-6含量(P<0.05)，尤其是醋炙高剂量组差异显著(P<0.01)，具有统计学意义，结果见表3。

[0027]表3 夏天无对CCl4致急性肝损伤小鼠血清TNF-a和IL-6的影响(，n=10)
注:与空白对照组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01
3.4醋炙夏天无提取物对肝脏病理变化的影响
肉眼观察，正常组小鼠肝脏呈鲜红色，富有弹性，且表面光滑；模型组小鼠肝脏肿大，颜色偏白，质地坚硬；醋炙夏天无组小鼠肝脏颜色较正常组颜色稍浅，损伤程度较轻；显微镜观察，模型组小鼠大量肝细胞空泡变性，中央静脉周围较多肝细胞坏死，胞核碎裂溶解；与
模型组相比，醋炙组与阳性组的肝损伤程度明显降低，表明醋炙夏天无对CCl4致急性肝损伤具有明显保护作用，结果见图1-5。

[0028] 4.0 讨论
肝脏是人体中物质转换和免疫调节的重要器官，慢性肝损伤是临床上常见的疾病，主要因遗传、病毒、化学物质、药物等因素引起肝细胞损伤甚至死亡，保肝药物的研发是当前科学界的热点。

本文采用经典的CCL4化学性急性肝损伤动物模型探究醋炙夏天无的保肝作用，CCl4致肝损伤机制是CCl4进入体内后，在肝微粒体细胞色素P450作用下，生成自由基CCl3，与脂质细胞膜反应，造成膜结构和功能完整性的破坏导致肝损伤[参考文献：闵清，白育庭，舒思洁，等.延胡索乙素对四氯化碳致小鼠肝损伤的保护作用.中国中药杂志，2006，31(6):483-484.]。

[0029]ALT和AST是反映肝细胞损伤程度的主要生化指标；肝细胞严重损时，ALT和AST大量释放，血清中转氨酶升高[参考文献：HWANG Y P，CHOI J H，JEONG H G.Protective effect of the Aralia continentalis root extract against carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity in mice[J].Food&Chemical Toxicology，2009，47(1):80-81]；实验结果表明，醋炙夏天无能明显降低血清中AST、ALT的含量。

[0030]SOD是重要的抗氧化酶，也是超氧自由基的清除因子，其活力的高低反映了机体清除氧自由基的能力[参考文献：曹后康，韦日明，张可锋，等．黄花倒水莲多糖对四氯化碳致急性肝损伤小鼠的保护作用[J]．中药材，2018，41(1):203-206．]。

GSH-PX是机体内的一种重要的过氧化物分解酶[参考文献：董亮，何永志，王远亮，等．超氧化物歧化酶（SOD）的应用研究进展[J]．中国农业科技导报，2013，15(5):53-58．]；MDA是脂质过氧化反应的终产物[参考文献：Recknage1 R O，G1ende E A，Dolak J A，et al.Mechanisms of car-bon tetrachloride toxicity.Pharmac Ther，1989，43(5):139.]， MDA的含量高低反映了机体细胞受自由基攻击时组织的过氧化损伤程度。

实验结果表明，醋炙夏天无能显著增强肝组织中SOD、GSH-PX的活性，降低肝组织中MDA含量。

[0031]TNF-α和IL-6是反应炎症程度的主要因子，CCl4致肝毒性中产生一系列炎症细胞因子IL-6、TNF-α等反应，造成肝细胞损伤[参考文献：WANG W，WANG S，LIU J，et al.Sesquiterpenoids from the root of，Panax Ginseng，protect CCl4-induced acute liver injury by anti-inflammatory and anti-oxidative capabilities in mice[J] .Biomedicine&Pharmacotherapy，2018(102):412-419.]。

本实验结果表明，醋炙夏天无组可以有效降低肝组织中IL-6、TNF-α的含量，说明能减少验证反应的发生。

[0032]综上所述，夏天无醋炙品能显著减轻CCl4所致的急性肝损伤，其保肝机制可能与抗氧化平衡和抗炎促炎平衡有关，但具体机制还需进一步探究。

夏天无作为活血镇痛药物，其保肝作用还未开发利用，本文对其保肝作用进行实验性探究，更好的验证其醋炙入肝这一说法，以期为将来的临床应用奠定基础。

[0033]尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

图1
图2
图3
图4
图5
说　明　书　附　图3/3页CN 112245473 A 11。