乳腺癌干细胞 BLM、RecQ4蛋白表达变化及意义

乳腺癌干细胞 BLM、RecQ4蛋白表达变化及意义
鲁媛;葛章文;刘杰麟
【摘要】Objective To investigate the expression changes of BLM and RecQ 4 helicases in breast cancer stem cells . Methods Breast cancer stem cells were screened from breast cancer MDA-MB-435 cells and were cultured in serum-free medium.The tumorigenicity of breast cancer stem cells and MDA-MB-435 cells was observed by tumor formation in nude mice.The drug resistance gene ATP-binding cassette transporter G 2 ( ABCG2) mRNA of stem cells was detected by RT-PCR.The protein expression of BLM and RecQ 4 was detected in breast cancer MDA-MB-435 cells and their stem cells by Western Blotting and fluorescent staining .Results The proportion of surface markers CD 44 +CD24 -/low in cancer stem cells was significantly higher , but the proportion of membrane surface CD 44
+CD24 +was significantly lower than that of MDA-MB-435 cells ( all P
<0.05).No statistical significance was found in the proportions of cell membrane surface CD44 -CD24 +and CD44 -CD24-between these two kinds of cells (all P<0.05).The mRNA expression of ABCG2 was 0.753
±0.025 in stem cells, and it was 0.563 ±0.112 in the breast cancer MDA-MB-435 cells (P<0.05).Compared with the nude mice inoculated with the same density of MDA-MB-435 cells, the nude mice inoculated with stem cells had an early tumor formation time and a large tumor volume .The BLM protein expression of stem cells was lower and RecQ 4 protein expression was higher than that of MDA-MB-435 cells (all
P<0.05).Conclusion The tumorigenicity is high in breast cancer stem cells , which may be associated with low expression of BLM and high expression
of RecQ 4 in breast canc-er stem cells.%目的：探讨乳腺癌干细胞BLM、RecQ4蛋白表达变化及其临床意义。

方法采用无血清培养法从乳腺癌MDA-MB-435细胞中分离乳腺癌干细胞（以下称干细胞），并鉴定。

观察MDA-MB-435
细胞裸鼠及干细胞成瘤能力，RT-PCR法检测二者ATP结合盒膜转运蛋白G2（ABCG2）mRNA相对表达量，Western blotting 法和免疫组化法检测二者BLM、RecQ4蛋白表达。

结果干细胞膜表面CD44＋CD24－／low比例明显高于、CD44＋CD24＋比例明显低于MDA-MA-435细胞（P均＜0．05）；两种细胞
膜表面CD44－CD24＋、CD44－CD24－比例比较差异均无统计学意义（P均＞0．05）。

裸鼠成瘤实验结果显示，与接种相同密度MDA-MB-435细胞比较，接种干细胞的裸鼠成瘤时间早、肿瘤体积大；干细胞ABCG2 mRNA相对表达量为0．753±0．025，MDA-MB-435细胞为0．563±0．112；两者比较P＜0．05。

干细胞BLM蛋白表达低、RecQ4蛋白表达高于MDA-MB-435细胞（P均＜0．05）。

结论乳腺癌干细胞成瘤能力强；细胞BLM蛋白表达降低、RecQ4蛋白表达升高可能为其机制。

【期刊名称】《山东医药》
【年(卷),期】2017(057)004
【总页数】4页(P17-20)
【关键词】乳腺癌;无血清培养;乳腺癌干细胞;RecQ家族解旋酶
【作者】鲁媛;葛章文;刘杰麟
【作者单位】贵州医科大学，贵阳550004;贵州医科大学，贵阳550004;贵州医
科大学，贵阳550004
【正文语种】中文
【中图分类】R392.9
肿瘤干细胞学说认为乳腺癌干细胞是乳腺癌发生、发展的根源[1,2]。

RecQ解旋酶是一种DNA解旋酶，人体中存在RecQL、BLM、WRN、RecQ4和RecQ5五种RecQ解旋酶，BLM、RecQ4突变将会导致相应疾病的发生，患者存在基因型不
稳定和癌症易患性等共同特征[3]。

2013年9月～2015年7月，本研究观察了乳腺癌干细胞(以下称干细胞)BLM、RecQ4蛋白表达变化，现分析结果并探讨其意义。

1.1 材料细胞：乳腺癌MDA-MB-435细胞由法国医学科学研究院陆核教授馈赠。

动物：雌性BALB/c系裸鼠18只，SPF级，4～6周龄，体质量16～20 g，合格
证号为S1K(黔)2002-0001，购于贵州医科大学动物房。

试剂：recombinant Human EGF、Recombinant Human FGF-Basic、B27 Supplement(50×) 均购
自美国Peprotech公司，鼠抗人CD24-FITC抗体、兔抗人CD44-PE抗体、同型对照均购自美国eBioscience公司，RecQ4抗体、BLM抗体、RecQ5抗体和β-actin抗体均购自美国Proteintech公司。

1.2 干细胞分离及鉴定
1.2.1 干细胞分离采用无血清培养法。

取对数生长期MDA-MB-435细胞，PBS
洗涤细胞2次，吸尽PBS液，加入胰酶消化2～3 min。

采用含10% FBS的DMEM/F12(1∶1)培养基中止消化，800～1 000 r/min离心5 min，弃上清。

采用含10% FBS的DMEM/F12(1∶1)培养基重悬细胞，台盼蓝染色计数。

将细胞以2×104个/mL接种至培养瓶，加入含生长因子的无血清DMEM/F12(1∶1)培养基
至8～10 mL，放入37 ℃、5% CO2培养箱中悬浮培养。

采取半换液法进行培养，当培养基颜色变黄时，进行全换液法培养。

悬浮培养3～4周，200倍光镜下观察其生长情况可见：存活下来的MDA-MB-435细胞(简称分离细胞)在完全培养基中贴壁生长，呈长梭形；转入无血清培养基培养后，随着培养时间延长，细胞由梭形变为圆形，呈悬浮生长，并成串形成微球体，细胞数量逐渐增多。

1.2.2 干细胞鉴定将MDA-MB-435细胞去掉培养基后PBS冲洗2次，胰酶消化
细胞。

将悬浮细胞移入离心管中，800～1 000 r/min离心5 min，弃上清。

将其
与1.2.1中的分离细胞采用PBS冲洗2遍，重悬成密度为2×107个/mL的单细胞悬液。

各取50 μL单细胞悬液于离心管中，分别加入50 μL PBS混匀，同时设实
验管、空白管、同型对照管。

实验管中加入5 μL CD44-FITC、0.625 μL CD24-PE，4 ℃避光孵育30 min。

PBS冲洗2遍，加入500 μL PBS重悬细胞，制成单细胞悬液。

空白管不加入抗体，同型对照管加入同型对照抗体，其余步骤同实验管。

采用流式细胞仪检测细胞膜表面CD44 CD24各表型细胞比例，包括CD44-
CD24+、CD44-CD24-、CD44 + CD24-/low、CD44+CD24+(其中
CD44+CD24-/low为干细胞表面标志物)，实验重复3次。

结果显示，分离细胞
膜表面CD44+ CD24-/low比例明显高于、CD44+CD24+比例明显低于乳腺癌MDA-MB-435细胞(P均<0.05)；两种细胞膜表面CD44-CD24+、CD44-CD24-比例比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；见表1。

证实分离细胞为干细胞。

1.3 相关指标观察
1.3.1 成瘤能力参照上述方法将MDA-MB-435细胞和干细胞分别制成单细胞悬液，台盼蓝染色计数，分别将其密度调整为1×105、1×104、1×103个/mL，4 ℃条件下保存。

将18只雌性裸鼠随机分为6组，每组3只。

各组均于两侧腋窝分别皮下注射上述密度的MDA-MB-435细胞和干细胞悬液100 μL。

接种后将裸鼠送回SPF级饲养室饲养，每天定时观察肿瘤生长情况，记录成瘤时间。

每周固定时
间采用游标卡尺测量肿瘤结节的最长径(a)和垂直方向最短径(b)，计算肿瘤体积(V)，V=0.5ab2，共12周。

1.3.2 ATP结合盒膜转运蛋白G2(ABCG2)mRNA表达采用RT-PCR法检测。

取MDA-MB-435细胞和干细胞分别加入裂解液，用加样器吹打数次，15～30 ℃放置5 min。

按照总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，采用M-MLV第一链合
成系统试剂盒逆转录成cDNA。

ABCG2上游引物：5′-TTAGGATTGAAGCCAAAGG-3′，下游引物：5′-TAGGCAATTGTGAGGCAATGAG-3′，扩增长度446 bp；以β-actin为内参，上游引物：5′-GTCATCACCATTGGCAATGAG-3′，下游引物：5′-CGTCACACTTCATGATGGAGTT-3′，扩增长度121 bp。

PCR反应体系25 μL：
上游引物(10 μmol/L)1 μL，下游引物(10 μmol/L)1 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，cDNA 2 μL(0. 2 μg)，去离子水补足至25 μL。

PCR反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；
70 ℃延伸10 min。

采用2%琼脂糖凝胶进行电泳，120 V电泳30 min。

凝胶成
像仪进行拍照，Image-Pro Plus 6.0软件分析灰度值。

以目的基因与β-actin基
因扩增产物电泳条带灰度值的比值计算ABCG2 mRNA相对表达量。

1.3.3 BLM、RecQ4蛋白表达①Western blotting法：采用蛋白抽提试剂盒提取MDA-MB-435细胞和干细胞总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。

配制8% SDS-PAGE、12% SDS-PAGE分离胶和5%浓缩胶，浓缩胶电泳80 V，分离
胶电泳120 V，当溴酚蓝刚跑出即可终止电泳。

PVDF转膜，室温下脱色摇床上摇动封闭1 h。

加入一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，次日在室温下脱色摇床上摇动孵
育1 h，TBST冲洗3次。

加入HRP标记羊抗兔IgG(1∶2 000)，室温下孵育1 h，TBST冲洗3次，进行电泳蛋白条带显影。

以Histone H3.1为内参，采用扫描仪
将胶片结果进行扫描，凝胶图象处理系统分析灰度值。

以目的蛋白和内参蛋白灰度
值的比值计算BLM、RecQ4蛋白相对表达量。

②免疫组化法：将MDA-MB-43
细胞和干细胞用预温的PBS冲洗3次，每次10 min。

加入4%多聚甲醛室温固定20～30 min，PBS冲洗3次，每次10 min。

采用0.2% TritonX-100透化10 min，加入5%羊血清室温封闭30 min。

加入BLM、RecQ5抗体(用1%羊血清稀释)，4 ℃过夜。

PBS冲洗3次后加入Cy3标记的山羊抗兔IgG(用1%羊血清稀释)，室温避光孵育30 min。

采用PBS冲洗3次，加入1% Hoechst33342(用PBS稀释)，室温避光孵育5 min，PBS冲洗3次，每次10 min。

加入抗荧光衰减剂，95%甘油封片。

荧光显微镜下拍照，采用Image J软件分析光密度值。

1.4 统计学方法采用SPSS17.0统计软件。

计量资料以±s表示，多组间比较采用
单因素方差分析，两组间比较采用t检验。

P<0. 05为差异有统计学意义。

2.1 成瘤能力接种1×105个/mL MDA-MB-435细胞的裸鼠于接种后第36天出
现结节，接种1×105、1×104个/mL干细胞的裸鼠分别于接种后第23、30天出现结节，并逐渐增大。

接种1×104、1×103个/mL MDA-MB-435细胞和接种
1×103个/mL干细胞的裸鼠均未成瘤。

与接种相同密度MDA-MB-435细胞比较，接种干细胞的裸鼠成瘤时间早、肿瘤体积大。

裸鼠接种不同密度MDA-MB-435
细胞和干细胞后1～3周均未成瘤，裸鼠接种MDA-MB-435细胞和干细胞后4～12周成瘤体积比较见表2。

2.2 ABCG2 mRNA表达干细胞及MDA-MB-435细胞ABCG2 mRNA相对表达
量分别为0.753±0.025、0.563±0.112；两者比较P<0.05。

2.3 BLM、RecQ4蛋白表达 Western blotting法：干细胞及MDA-MB-435细
胞BLM蛋白相对表达量分别为0.92±0.01、0.77±0.03，RecQ4蛋白相对表达量分别为0.78±0.01、0.95±0.03，两者比较P均<0.05。

免疫组化法：干细胞及MDA-MB-435细胞BLM蛋白表达(光密度值)分别为0.042±0.002、
0.032±0.001，RecQ4蛋白表达分别为0.056±0.002、0.076±0.001，两者比较
P均<0.05。

朱敬之等[4]在无血清培养基中添加了bFGF、EGF、B27等只维持细胞生存的必需营养物质，发现可使肿瘤干细胞增殖而形成微球体，维持不分化的状态；而非肿瘤干细胞则贴壁生长，最后死亡。

本研究采用无血清培养法富集MDA-MB-435细胞中的干细胞，研究结果显示，干细胞CD44+/CD24-/low比例明显高于MDA-MB-435细胞，说明成功从MDA-MB-435细胞中筛选出干细胞。

研究证实，肿瘤干细胞能在裸鼠体内形成完整的恶性肿瘤，并且有与原发肿瘤相似的组织学特性；体内高致瘤性是肿瘤干细胞重要的特性之一。

郭崇勇等[5]研究表明，富集的肿瘤干细胞体内成瘤性明显高于乳腺癌MCF-7细胞。

本研究裸鼠成瘤实验结果显示，与MDA-MB-435细胞比较，接种同样密度干细胞的裸鼠成瘤时间早、肿瘤体积较大。

ABCG2是一种多药耐药基因，均可以作为各种来源干细胞的重要标志物，在肿瘤干细胞的侵袭和转移中扮演重要角色[6]。

Hiraga等[7]研究发现，MDA-MB-231细胞中ABCG2 mRNA在侧群细胞的表达明显高于非侧群细胞。

本研究结果显示，干细胞ABCG2 mRNA相对表达量明显高于MDA-MB-435细胞。

以上说明乳腺癌干细胞具有高成瘤能力和高耐药性。

RecQ解旋酶是一个高度保守的蛋白质家族，在保持基因组的完整性上具有关键作用。

Sassi等[8]研究发现，BLM基因突变可能与乳腺癌的发生有关。

RecQ4与
p53可阻止mtDNA的不稳定性，从而抑制肿瘤的发生[9]。

RecQ4被认为与血液恶性肿瘤的发生相关，还可通过与生存素结合而避免乳腺癌细胞凋亡[10]。

但不仅RecQ4的突变会导致肿瘤的发生，其过量表达也会引骨肉瘤、前列腺癌、乳腺癌和宫颈癌等肿瘤的发生[11,12]。

研究表明，RecQ4在乳腺癌细胞中呈高表达，其与生存素结合而抑制乳腺癌细胞的凋亡[13]。

Lao等[14]研究表明，在直肠癌组织中BLM和RecQ4表达均增加。

本研究Western blotting法和免疫组化法检测结果均显示，干细胞BLM蛋白表达低于MDA-MB-435细胞，RecQ4蛋白表达高
于MDA-MB-435细胞。

综上所述，乳腺癌干细胞BLM蛋白表达降低、RecQ4蛋白表达升高，可能与其耐药性和成瘤能力强有关。

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