内生真菌的分离与鉴定实验报告

植物内生真菌的分离与鉴定目录：
一、背景（目的）
二、材料与方法
1、材料
1.1、大叶女真的叶、茎
1.2、培养基
2、方法：
2.1、采样方法
2.2样本前处理方法
2.3、分离方法
2.4、培养方法
2.5、形态鉴定
2.5.1、菌落形态观察
2.5.2、微观形态
2.6、分子生物鉴定
2.6.1、菌丝体的培养方法
2.6.2、基因的提取方法
2.6.3、ITS序列扩增
2.6.
3.1、引物、序列
2.6.
3.1、PCR反应体系
2.6.
3.2、PCR反应条件（循环次数）
2.7、测序
2.7.1、方法
2.8、序列分析方法
2.9、结果与分析
植物内生真菌的分离与鉴定
一、试验目的（背景）
真菌是吸收异养型的真核生物种类繁多植物内生真菌是一大类尚未被充分认识的菌许多真菌学家对此了解也不多。

从已有研究结果来看内生真菌具有重要的生态学意义和经济意义，其物种多样性也是非常丰富的，植物的生长环境直接影响内生真菌的生物多样性，植物物种的年代越久远，其生物内生真菌的多样性越丰富：抗病原性能越强的植物，其所含的内生真菌具有抗菌活性的可能行就越大；其所含的内生真菌有可能产生与植物相同或相似的抗菌无知或产生抗菌活性物质可能参与了药用植物的抗菌过程，本实验通过植物病原真菌和G+、G-细菌的抑制实验发现茎，根，花，种子或果实内生真菌的代谢产物具有不同程度的抑菌能力，并且对G+、G-有普片遍的抑菌作用。

研究和开发内生真菌的寻找新的抗菌活性物质具有广泛的应用前景。

当今世界，生物技术已迈入世界经济的支柱产业，真菌学在生物技术的大潮中得到了长足的发展。

真菌是原始的真核生物，具有广泛的多样性，真菌生长我繁殖迅速，在很短的时间内就可以得到比动物和植物多得多的后代，能够直接、快速地进行遗传性状分离的分析。

因此，真菌可以作为研究基础生物学过程中的一个重要工具，真菌基因的多样性以及真菌分子生物学的发展，为生物技术产业提供了一个广阔的天地。

二、试验材料与方法：
（一）：材料
1、大叶女真的茎，叶片
2、药品与试剂：
葡萄糖、蛋白胨、KH2P04·3H2O、MgSO4·7H2O，马铃薯、琼脂。

孟加拉红，青霉素，链霉素，甲基蓝，蛋白胨，酵母膏，蔗糖，磷酸盐，葡萄糖，琼脂条，无菌水等。

消毒剂：75%的乙醇，0.1%升汞（HgCl2），次氯酸钠溶液（含活性氯10%），30%双氧水。

双蒸水、琼脂糖，Tris饱和酚、巯基乙醇(β- Mercaptoethanol)，石英砂，Tris饱和酚，氯仿，异戊醇，无水乙醇，硼酸，冰醋酸，氯化钠，盐酸，氢氧化钠，EDTA，CTAB。

3、培养基的配置：
1、马铃薯、葡萄糖琼脂培养基
马铃薯汁 1000ml，葡萄糖20g，琼脂20g
（注：取去皮马铃薯200克，切成小块，加水1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯
块，将滤液补足至1000毫升，加葡萄糖20克，琼脂15克，溶化后分装，15磅灭
菌30分钟
2、察氏琼脂培养基
蔗糖30g，NaNO33g，MgSO4.7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4.7H2O 0.01g，K2HPO41g，琼脂13g，蒸馏水1000ml，自然pH
3、沙氏培养基
蛋白胨 1g，葡萄糖或麦芽糖 4 g，琼脂 1.5克，水 100 ml。

制法：1将上述物质称好，放入水中煮沸溶解（不必调PH即有5左右）分中号试管（约4毫升）包扎，高压115℃20分钟。

趁热斜好，凝固备用。

4、马丁氏培养基
葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，1%孟加拉红3.3mL，琼脂20g，水 1000mL，pH值自然。

抗生素用法与用量：培养基灭菌之后分装前按链霉素40U/mL，青霉素30U/mL用量加入，冷却到45℃左右未凝固时加入抗生素，混匀倒平板。

（二）：采样方法：
1、采样方法：贵州大学南区同心楼旁边直接采取大叶女真的树叶、树干茎。

2.样品前处理：
分别取根、茎、叶、果实，用洗涤剂在自来水下洗净。

老树皮用75%酒精进行表面消毒后，用镊子取出，于酒精灯上烧灼15秒至表面焦糊，切成1×1cm2大小置于PDA固体培养基上。

对于根、茎、叶、果实按下列程序进行表面消毒：75%的酒精漂（浸）洗2-3min→无菌水冲洗4-6次→0.1%升汞不同的消毒时间（见表2-2，共设置7个梯度）→无菌水冲洗4-6次→用灭菌滤纸吸干多余水分→无菌刀片将材料切成小块将根、茎的表皮、韧皮部、木质部大致分开，并切成0.5×0.5cm2大小。

将果实的外种皮去掉，消毒之后将内种皮去掉。

灭菌时，沥干的植物材料转放到烧杯中，记好时间，倒入消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻底。

在快到时间之前1-2分钟，开始把消毒液倾入一备好的大烧杯内，要注意勿使材料倒出，倾净后立即倒入无菌水，轻搅漂洗。

灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止。

灭菌液要充分浸没材料。

宁可多用些灭菌液，切勿勉强在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌。

3.内生菌的分离方法：
将上述组织块置于分离培养基上（每一平皿培养5块组织块）于27℃恒温培养，同时将上述消毒过程中最后一次冲洗组织块后的无菌水滴在培养基上平行培养，用以检测消毒是否彻底。

观察菌丝生长情况及污染情况。

4.纯化方法：
培养3-4天后及时采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌丝或菌落移种到新鲜PDA培养基上。

纯化3-4次以保证所得菌落为纯培养。

（三）.形态鉴定方法：
1.培养方法：
1.1培养基：查氏培养基、沙氏培养基和PDA培养基。

1.2.将4℃保存菌种活化2次；
1.3.将活化菌种分别点种PDA、沙氏、察氏平板，每重复3；
1.4.25℃恒温培养箱培养7天；
1.5.然后进行菌落特征描述，取一个平行进行制片（胶带子粘片法），观察个体形
态；
1.6.另两个平行继续培养至14天，取出；
1.7.重复步骤4，作为最终描述结果；
1.8.根据真菌分类鉴定手册和相关资料分析确该菌的归属。

2.制片方法：
胶带粘贴法：选用在显微镜油镜下观察细致不粗糙且粘性好的胶带。

取一小段胶带从菌落表面的中心向边缘粘，75%乙醇固定，乳酸石炭酸棉蓝染色液染色，将粘有菌丝的一面向上，盖上盖玻片，于显微镜下观察产孢结构等特征。

3.鉴定标准：
观察的要点：
（1）菌落宏观形态：
大小：以菌落的直径（mm）表示。

颜色：包括菌落表面和背面的颜色，及色素是否渗入培养基。

菌落表面的纹饰：如皱纹、辐射沟纹、同心环、整个菌落致密或疏松等。

菌落的质地：毡状、毯状、绒毛状、棉絮状、粉粒状、革质状、有无成束状或绳状的气生菌丝。

菌落的高度：扁平、凸起或隆起，及菌落中心部分状况等。

菌落边缘：全缘、锯齿状、树枝状等。

渗出物：菌落表面有无液滴及液滴的颜色等。

（2）个体形态：
菌丝的特征：表面性状（粗糙或光滑），宽度等
分生孢子梗：分支情况--简单或复杂，轮生或单生等；长短；基部粗糙或光滑等。

产孢结构的形态特征：形状，大小，着生状况（位置，单生、互生或成轮生体）
分生孢子的形态：形状，大小，表面状况，聚集方式（直链、斜链或聚集成
头）
（。

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