百里醌保护结肠炎小鼠和诱导胃癌细胞凋亡作用的机制研究

百里醌保护结肠炎小鼠和诱导胃癌细胞凋亡作用的机制研究背景百里醌(Thymoquinone, TQ)是毛莨科植物黑种草籽中分离提取出的有效单体。

别名2-异丙基-5-甲基-1,4-苯并醌,分子式为CloH1202。

研究报道百里醌具有抗氧化、抗炎性反应和抗肿瘤作用,可用于多种疾病的治疗,但对正常细胞毒性很小。

百里醌对多种炎性反应模型动物具有保护作用,例如百里醌能够治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎和实验性风湿性关节炎,抑制鼠脓毒性腹膜炎,减轻大鼠卡拉胶致爪子水肿现象,抑制COX-2表达及前列腺素在小鼠过敏性气道炎性因子的分泌等。

有研究表明百里醌可抑制由乙酸诱导的结肠炎模型大鼠,但也有研究与此相反,因此本文旨在研究百里醌对DSS结肠炎小鼠的预防和治疗作用,并探讨其可能机制。

百里醌可参与肿瘤细胞增殖、凋亡和耐药等诸多方面的调控,对数种肿瘤细胞及肿瘤动物模型均有一定的治疗作用,如结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌等。

百里醌治疗恶性肿瘤的研究已经进入Ⅰ期临床试验,成人实体肿瘤和骨髓恶性肿瘤的患者可耐受百里醌每天75-2600mg的用量,而无毒副反应发生。

百里醌以其高效、低毒、天然的特点在肿瘤预防、治疗方面逐步引起了国内外学者的关注,但其具体机制至今尚不明确。

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,死亡率占恶性肿瘤第二位,其发病率逐年增加,严重危害国人健康。

化学治疗是胃癌常用的治疗措施,常用的化疗药物5-氟尿嘧啶、顺铂和阿霉素等存在毒副作用大、肿瘤细胞易产生耐药等缺陷,因此,从天然化合物中寻找低毒、高效的抗癌药物有效抑制胃癌发展尤为重要。

然而,有关百里醌对胃癌干预作用的研究很少。

13年前Badary研究发现,百
里醌可降低苯并芘导致小鼠前胃癌的发生率,并推测可能是通过氧化、抗炎和加速解毒过程而抑制肿瘤的发生。

大量研究报道百里醌在抗炎性反应和抗肿瘤中通过不同形式发挥作用,包括调控活性氧生成、抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡和协同传统化疗药物等。

百里醌能够减弱传统药物使用后所产生的细胞毒性却不影响其治疗效果。

尽管在肿瘤细胞和动物模型中已有研究发现百里醌具有抗炎性反应和抗肿瘤作用,但对于结肠炎和胃癌的治疗较少涉及。

实验一百里醌对葡聚糖硫酸钠诱导小鼠结肠炎模型防治作用的研究目的：百里醌是毛莨科植物黑种草籽中分离提取出的有效单体,在抗肿瘤、抗氧化和抗炎性反应方面效果显著。

百里醌对结肠炎是否有治疗作用仍不明确。

本文的目的是验证百里醌对小鼠结肠炎模型是否具有预防和治疗作用。

方法：C57BL/6小鼠自由饮用100ml3%葡聚糖硫酸钠溶液7天制造结肠炎模型。

分别在不同时间灌胃给予5mg/kg、10mg/kg或25mg/kg百里醌,观察各组小鼠的死亡率、体重变化,分别于治疗结束时处死小鼠,并对病变部分进行大体观评分、组织学评分和生物化学检测,以验证百里醌预防和治疗效果。

结果：百里醌防治组可显著降低小鼠结肠炎模型死亡率及体重减轻,减少结肠相关性损伤、降低结肠组织大体观和组织学评分,并可显著下调MPO活性和MDA 水平,上调GSH水平,且呈浓度依赖。

结论：百里醌可预防和治疗DSS诱导的小鼠结肠炎模型,本文研究结果为临床上应用百里醌治疗结肠炎提供理论依据。

实验二百里醌对胃癌细胞增殖抑制和凋亡诱导作用的研究目的：百里醌对多种肿瘤细胞体内外生长均有抑制作用。

然而,百里醌诱导胃癌细胞凋亡机制仍然不明。

本文在细胞和动物水平,观察百里醌对胃癌细胞的作用,并研究百里醌抑制胃癌细胞增殖、诱导凋亡的机制。

方法：分别用25μM、50μM和100μM百里醌,干预胃癌细胞12、24或36h,CCK-8法检测细胞增殖变化。

不同浓度的百里醌干预胃癌细胞24h后,Hoechst33258染色法、流式Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡情况,Western-blot法检测Bax、Bcl-2、Bcl-x1、survivi、cyclin-D、Cyt-c、procaspase-3和procaspase-9的表达变化。

将人胃癌细胞接种于裸鼠右侧背部皮下,10、20、40mg/kg百里醌每隔3天行腹腔内注射一次,并用游标卡尺测量瘤体体积,接种后30d处死裸鼠。

观察裸鼠状态和移植瘤的生长状况,绘制生长曲线、称量瘤重、组织病理学观察瘤体形态结构变化及TUNEL方法检测细胞凋亡情况。

结果：百里醌可抑制胃癌细胞的生长,呈浓度依赖和时间依赖。

与对照组相比,百里醌处理后胃癌细胞凋亡比例和形态学凋亡状态显著增加,Western-blot法检测Bax表达上调,Cyt-c从线粒体释放入胞浆,Bcl-2、
Bcl-xl、survivin、cyclin D表达下调,caspase-3和caspase-9活性增加。

百里醌治疗组细胞皮下移植瘤生长速度较慢、体积较小,呈量效关系。

TUNEL法检测瘤体,随着药物浓度的增加凋亡细胞明显增多,差异有统计学
意义。

结论：百里醌可通过线粒体途径诱导胃癌细胞凋亡,并有效抑制人胃癌裸鼠皮下移植瘤的生长,呈量效关系。

实验三百里醌与5-氟尿嘧啶联合给药对胃癌细胞作用的研究目的：本部分研究在细胞水平和动物水平,观察百里醌与5-氟尿嘧啶联合应用对胃癌细胞增殖、凋亡的影响,并研究其可能机制。

方法：百里醌50μM与5-氟尿嘧啶75μg/ml 单独或联合应用,CCK-8法检测胃癌细胞活性变化,Hoechst33258染色法、流式
Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡情况,Western-blot法检测Bax、Bcl-2、Cyt-c、procaspase-3和procaspase-9蛋白的表达变化。

胃癌裸鼠皮下移植瘤模型给予百里醌20mg/kg、5-氟尿嘧啶19mg/kg单独或联合应用,每隔3天行腹腔内注射一次,并用游标卡尺测量瘤体体积,接种后第30天处死裸鼠。

观察裸鼠状态和移植瘤的生长状况,绘制生长曲线、称量瘤重、组织病理学观察瘤体形态结构变化及TUNEL方法检测细胞凋亡情况。

结果：百里醌可增加5-氟尿嘧啶诱导胃癌细胞凋亡的作用。

与对照组相比,胃癌细胞凋亡比例和形态学凋亡状态显著增加,Western-blot法检测Bax表达上调,Cyt-c从线粒体释放入胞浆,Bcl-2表达下调,caspase-3和caspase-9活性增加。

百里醌和5-氟尿嘧啶联合应用后,细胞皮下移植瘤生长速度较慢、体积较小,差异有统计学意义。

TUNEL法检测瘤体的凋亡细胞明显增多,差异有统计学意义。

结论：百里醌可增加5-氟尿嘧啶诱导胃癌细胞凋亡的作用,并能够加强5-氟尿嘧建抑制裸鼠皮下移植瘤生长和诱导肿瘤凋亡的作用。

表明百里醌有可能作为新型化疗辅助药物应用于临床。