气道上皮细胞对巨噬细胞表型和吞噬功能的影响及HIF-1α的作用

气道上皮细胞对巨噬细胞表型和吞噬功能的影响及HIF-1α的
作用
佚名
【摘要】目的:探讨气道上皮细胞对巨噬细胞表型和吞噬活性的影响及缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的作用.方法:将不同浓度(0、100、200、400和800μmol/L)氯化钴(CoCl2)处理或转染HIF-1αsiRNA的人支气管上皮(HBE)细胞与12-肉豆蔻酸13-乙酸佛波酯(PMA)诱导人单核细胞系THP-1分化的巨噬细胞共培养,RT-qPCR 检测HBE细胞HIF-1α的mRNA表达,流式细胞术检测巨噬细胞表面标志物的表达及对大肠杆菌的吞噬率.结果:CoCl2浓度依赖性增加HBE细胞HIF-1α的mRNA表达,8 h为峰值,同时CoCl2处理的HBE细胞也增加共培养的巨噬细胞CCL3、CD163、CD206和CCL18荧光强度比率,800μmol/L处理的HBE细胞作用最强;共培养8 h和12 h的巨噬细胞CCL3荧光强度比率增加最明显,而共培养24 h的巨噬细胞CD163、CD206和CCL18荧光强度比率上升更明显.转染HIF-1α-Homo-488 siRNA的HBE细胞对巨噬细胞CCL3、CD163、CD206和CCL18的刺激作用明显减弱.与不同浓度CoCl2处理的HBE细胞共培养24 h的巨噬细胞对大肠杆菌的吞噬率最初(60 min以前)均呈不同的上升趋势,其后吞噬率均降低.相对于正常HBE细胞共培养组,400和800μmol/L刺激组在各时点的吞噬率均降低,其中800μmol/L刺激组降低最明显.结论:低氧环境下气道上皮细胞早期增强巨噬细胞向M1优势转化,而长期低氧作用的气道上皮细胞抑制巨噬细胞吞噬作用并向M2优势转化,HIF-1α可能是这些过程的重要介质.
【期刊名称】《中国病理生理杂志》
【年(卷),期】2019(035)001
【总页数】9页(P141-149)
【关键词】气道上皮细胞;巨噬细胞;表型;吞噬;缺氧诱导因子1α
【正文语种】中文
【中图分类】R563;R363
慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的重要特征在于进行性气道炎症导致气流受限和肺功能持续减退,其临床过程中的关键事件是COPD急性加重(acute exacerbation of COPD，AECOPD)，后者更进一步加速
肺功能下降、损害健康状况并增加死亡风险，多由感染尤其是细菌感染触发。

巨噬细胞的重要功能之一是吞噬病原体，研究证明COPD患者气道巨噬细胞吞噬能力
减弱是细菌长期定植和AECOPD次数增多的核心[1]。

巨噬细胞作用发挥与其表型密切相关，已确定2种类型巨噬细胞：干扰素γ(interferon-γ，IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)诱导的促炎或经典活化巨噬细胞(M1
巨噬细胞),白细胞介素4(interleukin-4，IL-4)和IL-13诱导的抗炎或替代性活化巨噬细胞(M2巨噬细胞)。

其中M1巨噬细胞表达高水平促炎细胞因子，在宿主防御细菌和病毒中发挥核心作用；M2巨噬细胞有助于炎症的消退和损伤修复。

因此，这2种表型巨噬细胞的相对比例对COPD疾病发展具有重要影响。

COPD气道中的复杂环境可以改变高度可塑的巨噬细胞表型。

气道感染与严重的局部低氧相关，后者是COPD气道炎症微环境的一种常见现象。

COPD患者通气驱动减弱，气道阻塞，肺泡壁增厚，肺泡毛细血管被破坏，从而
在肺内形成缺氧区域。

此外，急性加重过程中气道的感染和炎症使得氧气被炎症细胞消耗，造成氧浓度低于1%(<8 mmHg)的低氧微环境。

已知肿瘤组织低氧环境
是肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAMs)表型转换的最主要原因[2]。

缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)是低氧和炎症过程中激活的一个关键转录因子，对免疫和炎症反应调节发挥关键作用，影响巨噬细胞炎性因子基因表达、表型和功能状态。

已报道COPD患者肺组织中支气管上皮和上皮下纤维化组织HIF-1α表达上调或下调[3]。

在部分人群HIF-1α遗传多态性与COPD呈正相关。

由于缺氧是COPD气道微环境的持续性特征，探讨低氧环境巨噬细胞表型转换和吞噬活性的调节至关重要。

气道上皮细胞是气道和外界环境接触的第一道屏障，其通过调节固有免疫在预防和控制气道感染发挥重要作用。

正常情况下，上皮细胞与巨噬细胞密切联系，气道上皮细胞-巨噬细胞通迅紊乱被认为是早期炎症信号的一个关键事件[4]。

我们假设低氧状态下气道上皮细胞-巨噬细胞异常的串扰可能是巨噬细胞表型和吞噬功能变化的重要诱因。

本研究以氯化钴(cobalt chloride，CoCl2)刺激气道上皮细胞模拟低氧环境，选择趋化因子配体3(chemokine ligand 3，CCL3)作为M1巨噬细胞标志物，CD163、CD206和CCL18作为M2巨噬细胞标志物，利用细胞生物学技术，探讨气道上皮细胞对巨噬细胞表型和吞噬活性的影响及HIF-1α的作用。

材料和方法
1 材料
人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cells，HBE cells; 江苏齐式生物科技有限公司)；人单核细胞系THP-1(杭州赫贝生物技术有限公司)。

CoCl2、12-肉豆蔻酸13-乙酸佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)和fluorescein isothiocyanate (FITC) isomer I(Sigma)；抗CD68抗体(Santa Cruz)；Alexa Fluor® 488 donkey anti-rabbit IgG(Life)；anti-human CCL3 PE、anti-human CD163 APC、anti-human CD206 APC、mouse IgG1κ
isotype control PE、mouse IgG1κ isotype control APC(eBioscience)；mouse anti-human CCL18 PE(BD)；溴化乙啶(ethidium bromide，EB；上海生工生物有限公司)；RNA提取试剂盒(上海捷瑞生物工程公司)；逆转录试剂盒PrimeScriptTM RT Master Mix(TaKaRa)；定量PCR试剂盒SuperReal PreMix Color(北京天根生化科技公司)。

Accuri流式细胞仪(BD)。

2 方法
2.1 THP-1细胞培养和诱导分化 THP-1常规培养于含10%类胎牛血清(similar fetal bovine serum，SFBS)的DMEM培养液，以每孔5.0×105铺至24孔细胞培养板中，加入终浓度为100 μg/L的PMA进行诱导分化。

24 h后，进行免疫荧光染色，显微镜下观察诱导分化的巨噬细胞。

2.2 HIF-1α siRNA转染 HBE细胞以每孔5.0×105的密度接种培养于不含抗生素的DMEM培养液(含10% SFBS)的24孔板，70%～80%融合后，换无血清培养液用于转染。

实验分5组：对照(control)组(不转染)、阴性对照siRNA(negative control siRNA, NC siRNA)组、HIF-1α-Homo-488 siRNA组、HIF-1α-Homo-1216 siRNA组和HIF-1α-Homo-1553 siRNA组。

siRNA均由GenePharma合成，序列见表1。

转染方法参照Lipofectamine 3000说明书，将5 μL siRNA 和5 μL Lipofectamine 3000分别溶于500 μL不含青霉素和链霉素的培养液中，室温静置5 min，混匀，静置20 min后加入24孔板中。

24 h后，利用RT-qPCR 评估沉默效率。

沉默效率最高的用于后续实验。

表1 siRNA序列Table 1.Sequences of the siRNANa meForward (5’-
3’)Reverse (5’-3’)Negative control siRNAUUCUCCGAACGUGU-CACGUTTACGUGACACGUUCG-GAGAATTHIF-1α-Homo-488 siRNAGGCGAAGUAAAGAAU-CUGATTUCAGAUUCUUUACUUCGC-CTTHIF-1α-Homo-1216 siRNAGGCCGCUCAAUUU-
AUGAAUTTAUUCAUAAAUUGAGCGGC-CTTHIF-1α-Homo-1553 siRNAGUAGCCUCUUUGA-CAAACUTTAGUUUGUCAAAGAGGC-UACTT
2.3 HBE细胞与巨噬细胞共培养 HBE细胞以5.0×105铺至24孔Transwell小室
上室，培养于含10% SFBS的DMEM。

24 h后换无血清培养基并以CoCl2处理，共分5组：HBE+CoCl2(0 μmol/L)组、HBE+CoCl2(100 μmol/L)组、
HBE+CoCl2(200 μmol/L)组、HBE+CoCl2(400 μmol/L)组和HBE+CoCl2(800
μmol/L)组。

各组细胞经CoCl2处理24 h，与上述诱导分化的巨噬细胞共培养8 h、12 h或24 h，收获上室HBE细胞用于随后的HIF-1α mRNA检测，收集下室巨噬细胞用于流式细胞术分析。

在证实CoCl2(800 μmol/L)和HIF-1α-Homo-488 siRNA实验效果最佳的基础上，为探讨HIF-1α的作用，将HBE细胞以每室5.0×105铺至24孔Transwell小室
上室，分3组：HBE+NC siRNA组(NC组)、HBE+HIF-1α-Homo-488 siRNA
组(siRNA组)和HBE+HIF-1α-Homo-488 siRNA+CoCl2(800 μmol/L)组(siRNA-800组)。

HBE细胞转染同2.2，CoCl2同时加入，然后与诱导分化的巨噬细胞共培养24 h。

2.4 乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性的测定按LDH测试试剂盒
说明书(博士德)用酶标仪(Bio-Rad)测量490 nm 的吸光度(A)值。

测定重复3次。

2.5 免疫荧光染色诱导分化的巨噬细胞以4%多聚甲醛4 ℃固定15 min，PBS漂洗，0.1% Triton X-100溶液穿透，1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)+0.3 mol/L甘氨酸封闭。

滴加CD68抗体200 μL，4 ℃过夜，室温30 min，PBS漂洗，滴加Alexa Fluor® 488 donkey anti-rabbit IgG 200 μL，37 ℃避光孵育1 h，PBS漂洗。

1% 4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)室温染核，PBS漂洗、甘油封片，荧光显微镜下(×200)观察、拍照。

2.6 RNA分离和RT-qPCR 按试剂盒说明用RNA快速提取试剂盒提取总RNA，定量并评估RNA完整性。

使用PrimeScriptTM RT试剂盒合成cDNA，进行反转录。

定量PCR试剂盒SuperReal PreMix Color进行qPCR。

β-actin表达作为内参照，数据使用2-ΔΔCt方法进行分析。

每个实验重复3次。

Homo-HIF-1α 的正向引
物序列为5’-AGGCTACTTGTATCTTCTG-3’，反向引物序列为5’-CGTTGTGAGTGGTATTATTC-3’；内参照Homo-ACTB的正向引物序列为5’-TAACGCAACTAAGTCATA-3’，反向引物序列为5’-TGAAGATCAAGATCATTG-3’。

2.7 流式细胞术分析巨噬细胞表面标志物的表达收集共培养的巨噬细胞，加入
450 μL的PBS重悬，各取110 μL到4支EP管中，分别加入5 μL 抗CCL3、
CD163、CD206和CCL18特异性抗体染色细胞，避光孵育30 min，同型对照细胞用PE或APC标记的mouse IgG1κ isotype染色，用于非特异性背景染色。

使用BD Accuri C6软件通过BD公司的Accuri C6流式细胞仪分析CCL3、CD163、CD206和CCL18的表达。

2.8 巨噬细胞吞噬大肠杆菌的检测按方法2.3将巨噬细胞与不同浓度CoCl2处理
的HBE共培养24 h；接种大肠杆菌于2%琼脂LB固体培养基平板上，37 ℃孵育24 h，挑取单个菌落于100 mL LB液体培养基中，37 ℃摇床过夜。

离心去上清，加入1.25 mL 1% Triton X-100和5 mL FITC (20 mg/L)，37 ℃避光孵育15 min，离心去上清，PBS重悬。

将FITC标记大肠杆菌加入共培养的巨噬细胞培养
液中(大肠杆菌∶巨噬细胞=20∶1)，37 ℃慢速摇动，每20 min取摇匀液0.5 mL，PBS漂洗，70%乙醇固定10 min，离心后加入1 mL EB(0.5 mg/L)，37 ℃避光
孵育15 min，运用流式细胞仪检测巨噬细胞吞噬大肠杆菌能力。

3 统计学处理
使用SPSS 13.0软件进行统计分析。

数据以均值±标准差(mean±SD)表示，多组
间比较采用方差分析，与对照组比较采用LSD法。

以P<0.05为差异有统计学意义。

结果
1 巨噬细胞的诱导分化
以CD68抗体作为巨噬细胞标志物，经100 μg/L PMA诱导24 h后，THP-1巨噬细胞组CD68免疫荧光染色阳性，而阴性对照组CD68免疫荧光染色阴性，表明THP-1细胞被诱导分化为巨噬细胞，见图1。

Figure 1.The immunofluorescence analysis of CD68 expression in the THP-1 cells (×200). The scale bar=50 μm.
图1 THP-1细胞CD68免疫荧光分析
2 siRNA对HBE细胞HIF-1α表达的影响
与NC siRNA组相比，HIF-1α-Homo-488 siRNA、HIF-1α-Homo-1216 siRNA 和HIF-1α-Homo-1553 siRNA均显著抑制HIF-1α的mRNA表达(P<0.05),其中HIF-1α-Homo-488 siRNA抑制效果最明显，因此选择HIF-1α-Homo-488 siRNA用于后续实验，见图2。

Figure 2.The relative mRNA expression levels of HIF-1α in the HBE cells transfected with siRNA. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs NC siRNA group.
图2 转染siRNA的HBE细胞HIF-1α mRNA相对表达水平的变化
3 CoCl2对HBE细胞LDH释放和HIF-1α表达的影响
100～800 μmol/L的CoCl2处理24 h后，HBE细胞的LDH释放量分别为
0.61±0.05 (100 μmol/L组)、0.64±0.03 (200 μmol/L组)、0.67±0.04 (400
μmol/L组)和0.68±0.04 (800 μmol/L组)，与对照组(0.61±0.03)比较差异均无
统计学显著性。

不同浓度CoCl2处理后，HBE细胞HIF-1α的mRNA表达水平均随CoCl2浓度的增加呈上升趋势，800 μmol/L为峰值；HIF-1α的mRNA水平上调在8 h为峰值，12和24 h渐减弱(P<0.05或P<0.01)，见图3。

Figure 3.The relative mRNA expression levels of HIF-1α in the HBE cells treated with CoCl2 at different concentrations. Mea n±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs 0 μmol/L group.
图3 不同浓度CoCl2作用HBE细胞后HIF-1α mRNA相对表达水平的变化
4 HBE细胞对巨噬细胞表型的影响
流式细胞术分析巨噬细胞表面标志物显示，与CoCl2处理的HBE细胞共培养的巨噬细胞CCL3、CD163、CD206和CCL18在8 h、12 h和24 h的荧光强度比率均随CoCl2浓度增加呈上升趋势，所有指标数值均在800 μmol/L达峰值,与正常HBE共培养组比较显著升高(P<0.05或0.01)；共培养8 h或12 h的巨噬细胞CCL3较CD163、CD206和CCL18荧光强度比率上升幅度更明显，而共培养24 h的巨噬细胞CD163、CD206和CCL18较CCL3荧光强度比率更明显，见图4～6及表2～4。

与转染HIF-1α-Homo-488 siRNA的HBE细胞共培养的巨噬细胞，其CCL3、CD163、CD206和CCL18荧光强度比率均较与未转染HBE细胞共培养的巨噬细胞明显降低(P<0.01)，见图7及表5。

5 HBE细胞对巨噬细胞吞噬的影响
与不同浓度CoCl2处理的HBE共培养24 h的巨噬细胞对大肠杆菌的吞噬率在60 min前均呈不同的上升趋势，其后吞噬率均较前降低。

相对于正常HBE细胞共培养组，400和800 μmol CoCl2刺激组在各时点吞噬率均降低，其中800 μmol/L 刺激组降低最明显(P<0.01)，见图8，9。

Figure 4.The expression of CCL3, CD163, CD206 and CCL18 on the macrophages co-cultured with HBE cells for 8 h was detected by flow cytometry. The HBE cells were pretreated with different concentrations (0, 100, 200, 400 and 800 μmol/L) of CoCl2 for 24 h.
图4 流式细胞术检测与经CoCl2处理的HBE细胞共培养8 h后巨噬细胞表面CCL3、CD163、CD206和CCL18的表达
Figure 5.The expression of CCL3, CD163, CD206 and CCL18 on the macrophages co-cultured with HBE cells for 12 h was detected by flow cytometry. The HBE cells were pretreated with different concentrations (0, 100, 200, 400 and 800 μmol/L) of CoCl2 for 24 h.
图5 流式细胞术检测与经CoCl2处理的HBE细胞共培养12 h后巨噬细胞表面CCL3、CD163、CD206和CCL18的表达
Figure 6.The expression of CCL3, CD163, CD206 and CCL18 on the macrophages co-cultured with HBE cells for 24 h was detected by flow cytometry. The HBE cells were pretreated with different concentrations (0, 100, 200, 400 and 800 μmol/L) of CoCl2 for 24 h.
图6 流式细胞术检测与经CoCl2处理的HBE细胞共培养24 h后巨噬细胞表面CCL3、CD163、CD206和CCL18的表达
表2 与经CoCl2处理的HBE细胞共培养8 h后巨噬细胞表面CCL3、CD163、CD206和CCL18的荧光强度比率
Table 2.The fluorescence intensity ratios of CCL3, CD163, CD206 and CCL18 on the macrophages co-cultured with HBE cells (with CoCl2
pretreatment for 24 h) for 8 h (%. Mean±SD. n=3)
GroupCCL3CD163CD206CCL18HBE+CoCl2(0
μmol/L)26.03±0.259.93±0.1511.03±0.257.87±0.42HBE+CoCl2(100
μmol/L)27.03±0.3110.07±0.1211.13±0.157.97±0.32HBE+CoCl2(200
μmol/L)28.63±0.64##10.13±0.1211.23±0.298.27±0.23HBE+CoCl2(400
μmol/L)32.10±0.40##10.37±0.06#11.63±0.15#8.83±0.25#HBE+CoCl2(800 μmol/L)33.03±0.45##10.73±0.15##12.33±0.25##9.30±0.36#
#P<0.05, ##P<0.01 vs HBE+CoCl2 (0 μmol/L) group.
表3 与经CoCl2处理的HBE细胞共培养12 h后巨噬细胞表面CCL3、CD163、CD206和CCL18的荧光强度比率
Table 3.The fluorescence intensity ratios of CCL3, CD163, CD206 and CCL18 on the macrophages co-cultured with HBE cells (with CoCl2 pretreatment for 24 h) for 12 h (%. Mean±SD. n=3)
GroupCCL3CD163CD206CCL18HBE+CoCl2(0
μmol/L)31.67±0.8721.97±0.5724.90±0.3016.00±0.30HBE+CoCl2(100
μmol/L)33.67±0.32#22.60±0.5024.97±0.2916.27±0.42HBE+CoCl2(200
μmol/L)34.93±0.91#23.37±0.29#25.27±0.2116.77±0.47HBE+CoCl2(400
μmol/L)36.67±0.45##23.73±0.38#25.77±0.40#17.57±0.46##HBE+CoCl2(80 0 μmol/L)40.00±0.26##24.43±0.32##26.53±0.49##21.03±0.12##
#P<0.05, ##P<0.01 vs HBE+CoCl2 (0 μmol/L) group.
讨论
本研究中，我们以CoCl2刺激HBE细胞模拟COPD发病过程中通常发生的低氧刺激，发现与不同浓度CoCl2处理的HBE共培养的巨噬细胞吞噬率初期均呈不同的上升趋势，相对于正常HBE细胞共培养组，400和800 μmol/L刺激组吞噬率
降低，其中800 μmol/L刺激组降低最明显。

我们还发现，CoCl2刺激的HBE细胞早期主要诱导M1巨噬细胞表型标志物CCL3荧光强度比率上升；在较迟些阶段主要诱导M2巨噬细胞表型标志物CD163、CD206和CCL18荧光强度比率增高；而转染HIF-1α-Homo-488 siRNA的HBE细胞对巨噬细胞所有表型分子的诱导效应明显减弱。

表4 与经CoCl2处理的HBE细胞共培养24 h后巨噬细胞表面CCL3、CD163、CD206和CCL18的荧光强度比率
Table 4.The fluorescence intensity ratios of CCL3, CD163, CD206 and CCL18 on the macrophages co-cultured with HBE cells (with CoCl2 pretreatment for 24 h) for 24 h (%. Mean±SD. n=3)
GroupCCL3CD163CD206CCL18HBE+CoCl2(0
μmol/L)37.83±0.3130.80±0.1733.30±0.6124.87±0.40HBE+CoCl2(100
μmol/L)38.17±0.3134.27±0.12##34.83±0.23#26.03±0.40#HBE+CoCl2(200 μmol/L)38.80±0.17##35.23±0.45##36.27±0.49##26.87±0.40##HBE+CoCl2 (400
μmol/L)39.07±0.32##37.53±0.40##39.07±0.40##29.37±0.81##HBE+CoCl2 (800 μmol/L)39.73±0.40##40.67±0.65##43.07±1.01##32.17±0.60##
#P<0.05, ##P<0.01 vs HBE+CoCl2 (0 μmol/L) group.
Figure 7.The effect of HBE cells transfected with HIF-1α-Homo-488 siRNA on the expression of CCL3, CD163, CD206 and CCL18 on the macrophages was detected by flow cytometry. The HBE cells and macrophages were co-cultured for 24 h. NC: HBE+negative control siRNA; siRNA: HBE+HIF-1α-Homo-488 siRNA; siRNA-800: HBE+HIF-1α-Homo-488 siRNA+CoCl2 (800
μmol/L).
图7 流式细胞术检测转染HIF-1α-Homo-488 siRNA的HBE细胞对巨噬细胞表
面CCL3、CD163、CD206和CCL18表达的影响
已报道COPD患者肺泡巨噬细胞吞噬细菌能力减弱[1]，导致气道细菌定植增加，后者促进气道慢性炎症、急性加重和病情进展；然而，巨噬细胞吞噬功能减弱的确切机制仍然不清楚。

巨噬细胞吞噬能力减弱可能与环境中炎症介质和表型转化有关。

低氧是潜在的免疫调节剂，HIF-1α可作为免疫调节的主要因子，低氧微环境下HIF-1α的初始诱导激活信号级联，增强杀菌活性；另一方面，HIF-1α活化又不
利于全身感染，导致更高的死亡率[5]。

最近的实验表明，HIF-1α也抑制气道上皮细胞的先天性免疫应答[6]。

因此，HIF-1α的下调可以在以慢性炎症为特征的疾病中具有治疗效果。

我们发现CoCl2浓度依赖性上调HBE细胞HIF-1α的mRNA
表达水平；在8 h为峰值，其后渐减弱。

将巨噬细胞与不同浓度CoCl2处理的HBE共培养24 h，再研究共培养的巨噬细胞对大肠杆菌的吞噬情况，我们观察到相对于正常HBE细胞共培养组，400和800 μmol/L刺激组吞噬率降低，其中
800 μmol/L刺激组降低最明显，表明随上皮细胞损伤时间延长、程度加重，低氧环境的气道上皮细胞可以减弱巨噬细胞的吞噬功能。

表5 与转染HIF-1α-Homo-488 siRNA的HBE细胞共培养24 h后巨噬细胞表面CCL3、CD163、CD206和CCL18的荧光强度比率
Table 5.The fluorescence intensity ratios of CCL3, CD163, CD206 and
CCL18 on the macrophages co-cultured with HBE cells (transfected with HIF-1α-Homo-488 siRNA) for 24 h (%. Mean±SD. n=3)
GroupCCL3CD163CD206CCL18NC35.80±0.2631.17±0.3133.83±0.7224.33±0.72siRNA21.67±0.21##17.43±0.12##20.47±0.29##14.67±0.40##siRNA-80022.50±0.10##25.83±0.49##29.20±0.52##18.60±0.44##
NC: HBE+negative control siRNA; siRNA: HBE+HIF-1α-Homo-488
siRNA488; siRNA-800: HBE+HIF-1α-Homo-488 siRNA+CoCl2(800 μmol/L). ##P<0.01 vs NC group.
Figure 8.The images of flow cytometric analysis for determining macrophage phagocytosis of E.coli.
图8 巨噬细胞吞噬大肠杆菌流式细胞术直方图
目前认为，M1和M2巨噬细胞亚群比例失调调控气道和肺部炎症的发生发展。

有证据表明，M1和M2巨噬细胞同时存在于COPD气道中[7]。

本研究中，我们观
察到类似现象，上皮细胞-巨噬细胞相互作用诱导巨噬细胞表型动态转换，在整个
共培养过程中，上皮细胞对巨噬细胞M1和M2表型标志物均有不同的诱导作用；但在早期，低氧激发的上皮细胞主要诱导巨噬细胞向M1表型转换，表现为CCL3荧光强度比率较CD163、CD206和CCL18上升更显著，表明急性组织损伤诱导
促炎性M1表型引起急性炎症反应。

之后，相同的刺激驱使M2表型优势转换，
这种现象与一些临床现象较符合，曾有报道显示吸烟者和COPD患者气道管腔中
M2巨噬细胞占优势，AECOPD患者支气管BALF中M2表型和M2相关基因上调，并且重度患者比轻中度患者CD163+、CD204+和CD206+肺泡巨噬细胞数
量和比例明显升高[8]。

M2巨噬细胞吞噬作用不足，因此，长期低氧环境下，气
道上皮细胞诱导巨噬细胞向M2型分化的比例高于M1型，巨噬细胞吞噬能力下降，可能是导致COPD肺部反复感染和频繁加重的重要原因之一。

Figure 9.The macrophage phagocytosis rate of E.coli. Mean±SD. n=3.
*P<0.05 vs HBE+CoCl2 (0 μmol/L) group.
图9 巨噬细胞对大肠杆菌的吞噬率
HIF-1α对巨噬细胞表型和功能状态的影响仍不确定，在对肥胖机制研究中发现，脂肪组织中低氧通过HIF-1α依赖性机制诱导巨噬细胞M1表型[9]；另外的研究显示，敲除HIF-1α的巨噬细胞M2标志物更加突出伴随细胞毒性降低。

但对肿瘤细胞或模型研究则呈现不同现象，在乳腺肿瘤PyMT转基因模型，肿瘤细胞糖酵解的副产物乳酸激活HIF-1α,调控TAMs精氨酸酶1(arginase-1，Arg-1; M2标志物之一)和诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)；特异性缺失HIF-1α的髓系细胞减弱TAMs表达Arg-1和iNOS。

本实验数据表明，支气管上皮细胞的HIF-1α对M1、M2标志物均有诱导作用，在不同时间、不同浓度状况下，诱导的程度不一样，较高浓度、早期可能主要诱导M1标志物，而低浓度、长时间作用情况下，则主要诱导M2标志物。

当然，HBE细胞诱导巨噬细胞表型标志物改变也不排除其它介质的参与。

总之，我们的结果表明，低氧作用的气道上皮诱使巨噬细胞吞噬作用减弱和向M1和/或M2重编程。

这些观察结果有助于从气道上皮-巨噬细胞相互作用的关系角度阐明COPD频繁发作型患者气道巨噬细胞表型转化和功能减退的分子机制。

调整气道上皮-巨噬细胞的信息交流，改善巨噬细胞吞噬功能，调节M1/M2比例，均有助于减轻气道炎症并降低COPD加重的风险。

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