硫氧环蛋白过氧化物酶3在血管紧张素Ⅱ诱导心肌肥大中的表达-最新年精选文档

硫氧环蛋白过氧化物酶3在血管紧张素U诱导心肌肥
大中的表达
1.1实验材料
H9C2大鼠心肌细胞（中国科学院上海生命科学研究院提供）；血管紧张素Sigma公司）；脑钠素上下游引物（上海吉玛公司）；M-MLV 逆转录试剂盒、SYBR+Tap昆合齐V （美国invitrogen 公司）；二氯荧光素二乙酸（Sigma公司）；Prdx-3抗体（Abeam 产品）。

1.2细胞培养及实验分组
心肌细胞在含10%胎牛血清浓度的杜尔伯科改良伊格尔培养基（DMEM中常规培养。

细胞在达到70%融合后，给予0.4%血清浓度DMEM!养12 h，使细胞同步化，然后随机分为对照组（仅0.4%血清浓度DMEM和Ang □组（经Ang II 1 X 10-6 mol/L 处理）。

1.3Real time PCR 法检测脑钠素（BNP mRNA表达[4]
细胞未经或经Ang I刺激6、12、24、48 h,弃培养液，利用Trizol提取细胞总RNA 定量后取0.5卩g RNA行逆转录。

取1卩L cDNA进行Real-time PCF扩增，扩增体系如下：SYRB+Taq 混合剂10卩L, Prx-1或GAPD上下游引物各0.5卩L, cDNA 1 卩L,双蒸水8卩L；扩增条件：95C变性30 s后，95C变性5 s , 60C退火30 s , 72C延伸30 s，共40个循环。

BNP上游引物序
列5' TGGGCAGAAGATAGACCGG，A 下3'游5'
ACAAC-CTCAGCCCGTCACAGGAPD上游弓I物5' GGC-ACAGTCAAGGCTGAGAA，下游引物5' ATGGTG-GTGAAGACGCCA35TAGAPD为内参照，各组BNPmRNA 表达量以各样本与对照组的倍数表示。

1.4二氯荧光素二乙酸（DCFH-D）检测ROS水平
DCFH-DA没有荧光，能自由穿过细胞膜，进入细胞后被酯酶水解生成还原型二氯荧光素（DCFH, DCFH不能通过细胞膜，但可被细胞内的ROS氧化生成氧化型二氯荧光素（DCF，DCF 可发出荧光。

因此DCF 的荧光量可以反映细胞内ROS水平。

本实验中，Ang H刺激心肌细胞0、5、10、20、40 min 和1 h, 0.25% 胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，加入DCFH-D，A 终浓度为10
卩mol/L , 37 C孵育20 min后，PBS洗3次，去掉未进入细胞内的DCFH-DA计数10 000个细胞，荧光酶标仪测定激发波长488 nm发射波长525 nm处的荧光强度。

1.5 Western blot 法检测Prdx-3 蛋白表达
细胞经或未经Ang H刺激30 min、1 h、3 h和6 h，弃培养液，PBS漂洗，细胞裂解液冰上震荡裂解30 min，收集裂解细胞，低温高速离心15 min，收集上清，-70C保存。

以考马斯亮蓝R-250染色测定蛋白浓度，每孔50卩g上样并电泳、转膜。

5%牛血清白蛋白封闭1 h , Prdx-3抗体（1 : 1000稀释），4C 孵育过夜。

二抗（1 : 3000稀释），室温孵育2 h。

BCIP/NBT
（1 : 50稀释）显色3 min o Image J软件对蛋白表达条带进行灰度定量分析，以Prdx-3与GAPD灰度比值作为Prdx-3表达值。

1.6 统计学方法
采用统计软件SPSS15.0 对数据进行分析，正态分布计量资料以均数土标准差（x±s）表示，两组间比较米用t检验；重复测量的计量资料比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。

以P 本研究利用Ang □作用于心肌细胞，发现在Ang II
刺激12 h时，BNP mRN的表达开始增高，随后随着刺激时间延长，表达逐渐增高，具有时效性，说明Ang I上调BNP基因的表达，刺激了心肌细胞肥大。

另外，Ang I作用5 min时心肌细
胞ROS的水平即开始增高，20 min时达到高峰，说明Ang I可刺激心肌细胞快速产生ROS同时我们还发现Ang I刺激心肌细胞30 min 时，Prdx-3 蛋白表达明显高于对照组，随后表达有所下降，提示Ang I还能快速上调心肌细胞Prdx-3表达。

推测Prdx-3蛋白在心肌细胞的快速上调可能与降低Ang I诱导的ROS 有关，但其后期表达不足可能会促进心脏的氧化应激，因此提高Prdx-3 的表达可能成为抑制高血压心肌肥大的新途径之一。