菜豆抗炭疽病苗期鉴定条件优化及种质资源抗性鉴定

菜豆抗炭疽病苗期鉴定条件优化及种质资源抗性鉴定
韩启厚; 古瑜; 于海龙; 夏俊峰; 刘惠静; 岳欣; 郎朗
【期刊名称】《《中国蔬菜》》
【年(卷),期】2013(000)008
【总页数】5页(P86-90)
【关键词】菜豆; 炭疽病; 苗期接种; 抗性鉴定
【作者】韩启厚; 古瑜; 于海龙; 夏俊峰; 刘惠静; 岳欣; 郎朗
【作者单位】天津科润蔬菜研究所天津300384
【正文语种】中文
【中图分类】S436.43
菜豆炭疽病是由菜豆炭疽菌〔Colletotrichum lindemuthianum（Sacc. et Magn.）Br. et Cav.〕引起的一种真菌性病害，可侵染菜豆叶片、茎秆及豆荚等。

感病品种一旦发病，减产在20%～30%；当温度（13～26 ℃）和湿度适宜的情况下，减产可达到100%（王坤等，2008）。

我国是世界上菜豆主产国之一，食荚菜豆产量居世界第一，籽用菜豆产量列世界第三（张子君等，2002）。

现阶段菜豆生产上防治炭疽病主要采用化学药剂防治，不仅耗费人力、物力，而且造成严重的环境污染。

选育抗炭疽病菜豆品种是防治菜豆炭疽病经济实用，也是最根本的措施。

选育抗病品种，首先要有抗病资源，苗期接种鉴定方法是筛选抗病资源、鉴定抗病品种最有效的方法（Inglis et al.，
1988）。

目前，对菜豆抗炭疽病苗期接种鉴定方法也有不少报道，但在实际操作中由于环境条件的差异，现有的鉴定方法主要存在以下问题：① 接种操作方法不统一，接种
菌液浓度差异大（浓度差异在几倍，甚至十几倍），易产生误差（冯国军等，2008；李梅，2009）；② 对环境条件要求高（多采用恒温箱控温、控湿）（冯国军等，2008），不容易达到要求，不利于大批量资源鉴定。

本试验结合前人鉴定方法及实际操作过程中存在的问题，对菜豆炭疽病苗期接种鉴定方法进行改良；在温室加小拱棚的条件下，利用优化的方法对23份菜豆资源进行苗期抗炭疽病接种鉴定，检验新方法实用性的同时了解菜豆种质资源的抗性。

1 材料与方法
1.1 试验材料
供试菌种：我国流行的毒力型炭疽病81号生理小种（编号Cll-07），由中国农业科学院作物研究所王晓鸣研究员提供。

供试材料：改良接种鉴定方法所用感病材料为双丰2号。

鉴定材料：共23份，包括双丰类型4份、架豆王类型3份、红花豆类型2份、九粒白类型3份、油豆类型7份、地豆类型4份。

菌种扩繁：首先将菌种接种于PDA斜面培养基（方中达，1998）（马铃薯20 g、葡萄糖15g、琼脂粉20 g、水1000mL）上，放于20 ℃恒温培养箱中黑暗培养，使其产生大量菌丝，活化病原菌，然后将PDA斜面培养基上产生的菌丝接种到产孢培养基上，恒温20 ℃条件下黑暗培养。

接种时用无菌水冲下产孢培养基上的孢子，滤除菌丝，配制成一定浓度的孢子悬浊液，悬浊液孢子浓度采用血球计数板计数。

接种条件：接种在加温温室内进行，接菌方法采用毛笔涂抹法，接种后在幼苗上方支一小拱棚，接菌后每天喷雾保湿，始终保证幼苗叶片有细小的水雾，控制拱棚内温度在20～25 ℃，空气湿度80%～100%。

1.2 试验方法
1.2.1 产孢培养基及培养时间筛选采用3种产孢培养基，分别为MA培养基（葡
萄糖2.80 g、硫酸镁1.23g、磷酸二氢钾2.72 g、蛋白胨1.00 g、琼脂20 g、蒸馏水1000mL）、豆叶汁培养基（MA培养基+200 g鲜豆叶榨汁）和豆荚培养基（MA培养基+200 g鲜豆荚）。

将3种灭菌后的液态培养基倒入直径为90mm
的培养皿中，培养基厚度0.3mm左右。

待培养基凝固后，从长满炭疽病菌丝的PDA培养基上切取0.5mm见方的菌块，转接到产孢培养基上，每个培养皿转接1块，盖好培养皿并用封口膜封好。

整个过程在超净工作台内完成。

接种好的培养皿放置在恒温培养箱内黑暗培养，培养温度为20 ℃。

培养时间设置10、20、30、40d 4个处理，每个处理接上述3种不同培养基各3皿，3次重复。

取孢子时，向长满菌丝的培养皿内加入5mL灭菌水，用毛笔轻轻
刷下培养基表面的孢子，纱布过滤后用血球计数板测定孢子数量。

1.2.2 接种菌菌液浓度筛选接种菌菌液浓度设3个处理，分别为1.0×106、
2.0×106、
3.0×106个·mL-1的孢子悬浊液，均匀涂抹到两叶一心的菜豆幼苗第1片真叶上，每个处理5株，3次重复，共45株。

分别在接种后5、7d调查发病情况。

1.2.3 病原菌培养时间筛选当菜豆幼苗两叶一心时，分别将培养了10、20、30d
的病原菌配成菌液浓度为2.0×106 个·mL-1的孢子悬浊液，均匀地涂抹在第1片真叶上，每个处理4株，3次重复，共36株。

接菌后分别于5、7d调查发病情况。

1.2.4 接种位置筛选当菜豆幼苗两叶一心时，配制浓度为2.0×106 个·mL-1的孢
子悬浊液，均匀涂抹在第1片真叶上，设正面、背面、正面+背面3个处理，每个处理5株，3次重复，共45株。

分别在接种后5、7d调查发病情况。

1.2.5 菜豆种质资源苗期炭疽病抗性鉴定根据上述试验得到的菜豆苗期炭疽病接种的优化方法，以双丰2号为感病对照（CK），对所收集的23份菜豆种质资源进
行苗期炭疽病抗性评价，每份材料15株，不设重复。

菜豆单株抗感分级标准和抗性评价标准参照古瑜等（2011）的方法。

共分为9级：0级，叶片上无病斑；1级，叶片上有零星点状病斑；3级，叶片上病斑较小，长1～2mm；5级，叶片上病斑较大，长2.1～5.0mm；7级，病斑大，长5.1mm
以上；9级，病斑多数相连，叶片萎蔫。

抗性评价根据病情指数来进行划分：高抗（HR），病情指数范围0～25.0；中抗（MR），病情指数范围25.1～50.0；中
感（MS），病情指数范围50.1～75.0；高感（HS），病情指数范围75.1～100.0。

1.3 数据分析
试验数据采用DPS软件进行方差分析，采用Duncans’s新复极差值法进行显著性检验。

2 结果与分析
2.1 培养基配方和培养时间对菜豆炭疽菌产孢数量的影响
如表1所示，3种培养基产孢数量在培养40d内都呈现先升高后降低的趋势，在
30d时均达到最高峰，其中豆荚培养基的变化幅度最大。

培养10d后，3种培养
基产孢数量差异不显著，但以豆荚培养基产孢数量最多；培养20、30、40d后，豆荚培养基的产孢数量均极显著高于MA培养基和豆叶汁培养基，分别是MA培
养基和豆叶汁培养基产孢数量的14.88、73.69倍，17.87、42.02倍和23.65、99.48倍，而MA培养基和豆叶汁培养基的产孢数量差异均不显著。

表1 不同培养基和培养时间对菜豆炭疽菌产孢数量的影响注：表中同列数据后不
同小写字母表示差异显著（α=0.05），不同大写字母表示差异极显著（α=0.01）；下表同。

处理产孢数量/×106个·mL-1培养10d 培养20d 培养30d 培养40d MA 培养基1.88±1.09 aA 6.24±2.68 bB 7.43±3.16 bB 2.65±0.27 bB豆叶汁培养基1.45±0.87 aA 1.26±0.38 bB 3.16±1.97 bB 0.63±0.06 bB豆荚培养基
11.33±10.21aA 92.85±8.45 aA 132.77±13.84 aA 62.67±16.61aA
2.2 菌液浓度对菜豆炭疽病发病情况的影响
如表2所示，接种第5天时，菌液浓度分别为2.0×106个·mL-1和3.0×106个·mL-1的处理菜豆幼苗炭疽病病情指数差异不显著，但显著高于1.0×106个·mL-1的处理。

可见，菌液浓度低，幼苗发病速度慢，可能是由于菌液中孢子数量不足造成的；而菌液浓度较高时，孢子从气孔进入叶片组织，由于气孔数量有限，多余的孢子不能顺利进入叶片组织，也就丧失了致病能力。

因此，本试验认为接种菌液的最佳浓度为2.0×106个·mL-1。

表2 接种菌菌液浓度对菜豆炭疽病发病情况的影响菌液浓度/×106个·mL-1 病情
指数5d 7d 1.0 55.95±4.29 bA 1002.0 79.76±3.15 aA 1003.0 80.95±8.58aA 100
2.3 菌种培养时间对菜豆炭疽病发病情况的影响
如表3所示，随着菌种培养时间的延长，菜豆幼苗炭疽病病情指数先升高后下降，接种培养20d菌种的菜豆幼苗炭疽病病情指数为67.86，极显著高于接种培养
10d和30d的处理。

可见，菌种培养时间不能太短，亦不能过长，时间过长培养
基的营养不能满足孢子的生长，而使部分孢子侵染能力下降，因此接种应选择培养时间在20d左右的菌种，菜豆幼苗炭疽病发病效果最好。

2.4 接种位置对菜豆炭疽病发病情况的影响
从表4可以看出，3种接种方法均能使菜豆幼苗叶片感病。

接种5d后，背面接种的菜豆幼苗炭疽病病情指数极显著高于正面接种，背面接种不仅发病速度快，而且效果好于正面接种；背面接种和正面+背面接种的致病效果无显著差异。

接种7d 后，3个处理的菜豆幼苗炭疽病病情指数均达到100。

可见，炭疽病病菌均能浸染菜豆幼苗叶片正面和背面，而以叶片背面最容易侵入。

综合考虑致病效果及耗时等因素，菜豆幼苗叶片背面为最佳接种位置。

2.5 不同类型菜豆种质资源苗期炭疽病抗性鉴定
从表5可以看出，23份菜豆材料中仅5份材料对菜豆炭疽病有抗性，其中超早三叶紫花架对菜豆炭疽病表现为高抗。

5份抗性资源中有4份是油豆类型，1份是地豆类型，栽培区域都比较局限，而栽培面积较广泛的架豆王类型、红花豆类型、双青玉豆类型、九粒白类型的材料均不抗菜豆炭疽病。

表3 菌种培养时间对菜豆炭疽病发病情况的影响培养时间/d 病情指数5d 7d 10 19.05±5.46 bB 10020 67.86±16.36aA 10030 25.60±2.28 bB 100
表4 接种位置对菜豆炭疽病发病情况的影响处理病情指数5d 7d正面
51.11±4.44 bB 100背面92.59±5.13 aA 100正面+背面94.07±2.56aA 100
表5 不同类型菜豆种质资源苗期炭疽病抗性鉴定结果注：HR—高抗；MR—中抗；MS—中感；HS—高感。

病情指数抗性品种病情指数抗性100 HS 河南老来少
92 HS 91 HS 超早三叶紫花架 10 HR 76 HS 哈优1号 68 MS 88 HS 哈优2号71 MS 100 HS 大马掌 100 HS瑞丰架豆王 81 HS 长春60大油豆 35 MR泰国架豆王 98 HS 太空大将军油豆 26 MR红玉架豆王 84 HS 金满架 42 MR红花白荚
78 HS 无筋绿地豆 35 MR红花青荚 85 HS 新研地豆王 83 HS连农97-5 90 HS
美国兰湖 85 HS特长白荚王 93 HS 美国供豆王 58 MS
3 结论与讨论
本试验结果表明：豆荚培养基为最佳产孢培养基，产孢速度最快，可以在短时间内培养出试验所需的孢子数量；2.0×106 个·mL-1为最佳菌液浓度，菜豆幼苗炭疽
病病情指数最高；20d为最佳产孢培养时间，产孢数量多，侵染能力强；叶片背
面为最佳接种位置，接种鉴定效果最好。

豆荚培养基产孢效果好，可能是由于豆荚中含有大量利于菌种生长所需的营养物质，有利于孢子的产生，产孢数量多而且快，这与李梅（2009）试验的结果相同。

接
种浓度是抗病性鉴定的关键，国外多采用1.0×106～10.0×106个·mL-1
（Fernandez et al.，2000；Celeste，2006），但以1.2×106 个·mL-1居多，
而国内接种浓度基本在0.5×106～3.0×106个·mL-1（梁燕等，1992；冯国军等，2008；李梅，2009；张婷等，2012）之间，主要是由于接种环境条件不同，导致接种浓度存在差异。

del Río等（2003）在进行接种鉴定时将孢子悬浮液喷雾在叶片背面，接种效果较理想。

本试验结果证实了接种菜豆叶片背面发病效果要好于正面，主要是炭疽病病原菌孢子主要经过气孔侵入叶片细胞，而叶片背面气孔数量要多于叶片正面，因而染病效果更加明显。

菌种培养时间也是影响病菌致病力的重要因素之一。

菌种培养时间过短或过长，侵染效果均不佳，本试验结果与李梅（2009）的试验结果基本一致，菌种培养时间20d为宜。

接种方法多采用高压喷雾或普通喷雾器喷雾（张子君等，2002；王坤等，2008），所需菌液较多，不
仅浪费而且容易造成二次污染，改为毛笔涂抹，可以节约菌液，定量接种。

本试验优化了菜豆苗期接种鉴定方法，在保证接种效果稳定、可重复性强的前提下，简化了操作步骤，减少了误差；利用简单工具，降低成本，提高了效率。

可应用于大批量种质资源苗期炭疽病抗性鉴定，但苗期只是菜豆生长的一个阶段，随着菜豆的生长，其对炭疽病的抗性是否会出现变化，成株期植株本身或豆荚是否对炭疽病具有同样的抗性，还需要做进一步研究。

架豆王类型、双丰类型、九粒白类型等国内主栽的菜豆品种，对菜豆炭疽病81号生理小种均不具有抗性，一旦气候条件适合，将造成严重的经济损失。

油豆类型和地豆类型资源中有部分品种对81号生理小种表现为抗病，有的甚至免疫，这为菜豆抗炭疽病育种提供了很好的杂交亲本。

81号生理小种是国内主要流行的菜豆炭
疽病生理小种，但也不能忽视对其他生理小种的研究，因此今后还应该密切关注国内菜豆炭疽病生理小种变异情况，并广泛收集国内外种质资源，以期通过杂交及转基因等手段培育出抗多个菜豆炭疽病生理小种的菜豆品种。

参考文献
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