荧光定量PCR

Tumor RNA
0.018
基因表达差异
实验结果
0.018/0.0115=1.6
2 1.8 1.6 1.4 1.2
ERBB2的表达差异
Relative Expression
1 0.8 0.6 0.4 0.2 0
Healthy Tissue
Carc. Tissue
基因表达差异
温度梯度功能的应用
SNP检测-基因型分析
SYBR Green I 优点
使用方便 ——不必设计复杂的荧光探针
便宜 灵敏
SYBR Green I 缺点
与非特异性产物结合
熔解曲线
Molecular Beacons
Molecular Beacons
发夹型杂交探针
Molecular Beacons
环
环与目标序列完全配对
茎
荧光素 淬灭剂
SYBR Green I 工作原理
SYBR Green 1 结合到双链DNA的小沟部位
G TGCAC G T TA G A T G A T GT C A G G G CA AT C C CCTAC AC
SYBR Green 1 染料和双链DNA结合后荧光信号大
大增强。
荧光信号值与扩增产物量成正比
基因表达差异
使用 TaqMan 探针进行双通道荧光定量
Fam标记目标基因探针 （ERBB2 oncogene ） VIC标记看家基因探针（GAPDH）
基因表达差异
实验流程
基因表达差异
标准曲线
基因表达差异 样本扩增曲线
PMT1-FAM detection- ERBB2 PMT2-VIC detection- GAPDH
退火温度58－60，低于探针10
荧光定量PCR技术的应用
荧光定量技术在医疗上的应用
（一） 病原体检测
疾病的诊断－－适用于病毒、细菌、寄生虫 等所有病原体的检测 建立分子诊断标准－－病原体数量与治病性
对疗效的评价 对药效的研究
荧光定量技术在医疗上的应用
（二）遗传病诊断
等位基因检测
多基因遗传病的突变检测
F
G
5’ C
Q
5’
3’
Polymerase
SNP检测-基因型分析
从病人血液样品中提取 DNA 基因型分类： A/A (Allele 1)
G/G (Allele 2) G/A (Heterozygote)
T
V Q
C
F Q
SNP检测-基因型分析
• Allele 1 control
SYBR Green I 熔解曲线分析
Fluorescence decreases
Tm
Temperature increases
• 荧光强度Vs温度 • 荧光强度的变化是由于 – 温度不断升高 – 双链DNA解离，SGI重新游离到溶液中
• Tm是熔解曲线的特征值
SYBR Green I 熔解曲线
基因表达差异 结果分析
Copies ng/ µl Total RNA
Healthy RNA
Tumor RNA 2130 2492 136000 130800
ERBB2
1095 1052 95500 85730
GAPDH
基因表达差异 结果分析
Copies ng/ µl Total RNA
ERBB2 copies / GAPDH copies Healthy RNA 1095 / 95500 = 0.011 1052 / 85730 = 0.012 2130/136000 = 0.017 2492/130800 = 0.019 0.0115
Ct值的概念
•CT值的定义是PCR扩增过程中，荧光信 号开始由本底进入指数增长阶段时，达到 一个人为确定的阈值所对应的循环次数。
阈值线
Ct 值 C(t) value
C(t) value
18.12 +/- 0.04
Threshold line
Ct值
荧光定量PCR原理
• • • • 理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n •n：扩增反应的循环次数 •X：第n次循环后的产物量 •X0：初始模板量 •Ex：扩增效率
SYBR Green I进行SNP分析
Match
Mismatch
科研方面的应用
科研方面的部分应用（1）： 分子生物学方面：
研究各种处理对细胞mRNA含量变化的影响 比较染病组织与正常组织中各种mRNA含量差异
DNA或RNA的转染量与实验结果关系的研究
基因整合拷贝数的研究
研究方面的应用
科研方面的部分应用（2）： 植物学方面： 转基因植物中基因拷贝数与性状的关系 监测转基因植物中基因拷贝数的变化 转基因植株早期的筛选
研究方面的应用
其他方面的部分应用（2）：
公安系统相关 ： 个人身份鉴定 物证的各种鉴定 人种的鉴定
考古方面
物种分类
谢谢
5’ 3’
Mismatch for Allele 1
Reduced Efficiency of Probe Hybridization
5’ 3’
F
G
Q
V
C
C
Digestion of probe - fluorescence
NO digestion of probe - NO fluorescence
具体应用实例
基因表达差异
ERBB2 的表达（正常组织vs. 肿瘤组织）
目标基因：ERBB2 oncogene 看家基因：GAPDH 模板 从 正常乳腺组织中提取的 Total RNA 从乳腺癌组织中提取的 Total RNA 含 ERBB2 and GAPDH 的质粒用于生成标准曲线
研究方面的应用
科研方面的部分应用（3）：
动物学方面： 动物疫情监测 新的防止疫情发生及控制的药物及方法的研究 转基因动物中目的基因拷贝数与品质的关系研 究及早期筛选
其他方面的应用
其他方面的部分应用（1）：
进出口检验相关 ：
动物检疫，如各种动物流行病 植物检疫，如各种植物流行病 有害动物，特别是昆虫 食品检测，如各种有害病原微生物，如 病毒、细菌、支原体 转基因植物检验，如转基因大豆、西红 柿等
荧光化学试剂总结
化学试剂
工作原理 结合于双链 DNA的小沟 中
发夹型杂交探 针
有否淬灭剂
信号检测
主要应用范围 定量
否 有
延伸 复性
任何 步骤
融解曲线分析 SNP分析
定量、定性
SNP分析
水解型杂交探 针（5‘-3’外 切）
有
定量、定性
荧光定量实验条件的优化
引物浓度：0.1－0.5uM（建议HPLC纯化） 融解曲线分析－－产物特异性 MgCl2浓度的调节
SYBR Green I进行SNP分析
PCR primers with SNP site at 3’ end
PCR #1
5’
C
PCR #2
5’
T
• 末端不匹配会导致PCR效率上有大约1000倍的差异，由此 导致产物积累会有10个cycles延迟 • 末端匹配与否，与反应终产物量的多少没有必然联系
Molecular Beacons 优缺点
对目标序列有很高的特异性 用于SNP检测的最灵敏的试剂之一 荧光背景低
设计困难 只能用于一个特定的目标 价格较贵
TaqMan探针
TaqMan
荧光素
探针 淬灭剂
水解型杂交探针
TaqMan探针工作原理
3’ 5’ 5’ 3’
Forward Primer
XCt=X0 (1+Ex)Ct =N log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log N
原理：初始模板量的对数值与C(T) 值之间
呈线性关系
荧光定量分析原理
荧光化学
SYBR Green 1
Molecular Beacons
TaqMan
SYBR Green I
SYBR Green 1
R Q
Reverse Primer
TaqMan 应用范围
定量起始模板浓度
鉴定PCR产物(定性）
单核苷酸多态性（SNP）检测
TaqMan 优缺点
对目标序列有很高的特异性 ---适合于SNP检测
与 Molecular Beacons 相比设计相对简单 价格较高 只适合于一个特定的目标 背景比分子信标探针高
茎由互补配对的序列组成
Molecular Beacons
AC
目标序列
GA AC A G T C CT T G G TG A G G A T G AT GT C A C AT C CT AC Q
茎
荧光素
淬灭剂
Molecular PCR产物(定性）
单核苷酸多态性（SNP）检测
基因表达异常所致遗传病检测
荧光定量技术在医疗上的应用
（三）肿瘤诊断
肿瘤相关基因表达的检测 癌基因 抗癌基因如P53基因
肿瘤标志物（肽类、激素和酶） 一般人群中疾病的检查 有症状患者的诊断 有助于选择适宜的治疗 对治疗响应的监测
荧光定量技术在医疗上所引发的研究课题
1. 病原微生物含量与病情之间的关系 2. 新的病原体分子诊断标准 3. 超早期感染治疗用药物及疗法的研 究与开发 4. 病原微生物含量与用药之间的关系 5. 新的愈后指标的研究 6. 传染病的发病监控、预测与预防 7. mRNA的表达水平与染病及病情之 间的关系 8. 等位基因与遗传病之间的关系 9. SNP与体质遗传病之间的关系 10. SNP与药物疗效之间的关系
实时荧光定量PCR原理与应用
•基本原理
•应用
•仪器介绍
常规PCR
常规PCR技术：
对PCR扩增反应的终产物进行定性分析
S1 S2 M
DNA Engine
荧光定量PCR
实时荧光定量PCR技术：
通过实时检测PCR每一个循环扩增产物相对应的荧 光信号，来实现对起始模板进行定量及定性的分析
•如何对初始模板定量 •荧光信号如何产生？
与双链DNA结合，可进行熔解曲线分析
排除非特异性扩增产物的干扰。
Amplicon
Amplicon Non-specific product
不同读板温度对实验结果的影响：80℃
不同读板温度对实验结果的影响：86℃
1. 94 ℃ 5 min 2. 95 ℃ 5 sec 3. 58 ℃ 30 sec 4. 72 ℃ 30 sec 5. 80 ℃ 3 sec 6. Plate read 7. 86 ℃ 3 sec 8. Plate read 9. Goto step 2 for more 39 times 10. Perform melting curve from 55.0 ℃ to 95.0 ℃,read every 0.2 ℃, hold for 1 sec
VIC FAM
SNP检测-基因型分析
• Allele 2 control
FAM VIC
SNP检测-基因型分析
• Heterozygote control
FAM VIC
SNP检测-基因型分析
Sample 1 2 3 4 5 6 FAM 21.80 N/A 21.20 N/A N/A N/A VIC 22.70 20.00 22.70 21.10 21.40 20.67 Genotype G/A A/A G/A A/A A/A A/A
助解链剂DMSO的使用（<5%）
退火温度的优化－－温度梯度功能
扩增片段的长度
双通道实验利用温度梯度功能
TaqMan探针及引物设计原则
GC含量30－80％ 探针设计
5’端避免出现重复的G碱基
探针的退火温度68－70 先设计探针，再设计引物
引物设计
正向引物与探针的距离
尽量避免重复的G出现
SNP G/A
Forward primer Reverse primer
F G Q
F
G
Q
V
Allele-specific probe
Allele-specific probe
F
C
T
Q
V
T
Q
R
SNP检测-基因型分析
F G T
Q
Q
Q
V
Match for Allele 1
Hybridization of TaqMan Probe